本发明专利技术提供了一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Ｑ↓［１０］的方法，所述方法包括：以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积１～５％的大豆油，于２５～２８℃下培养２４～３６ｈ后，加入体积为液体培养基体积０．２～０．５倍的正己烷，于２５～２８℃下发酵萃取耦合６～１２ｈ，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层经分离纯化得到所述的辅酶Ｑ↓［１０］。萃取溶剂回收率高，节约人力物力，方法简便省时、辅酶Ｑ↓［１０］收率高，利于工业化生产。
【技术实现步骤摘要】
一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q1Q的方法(一 )4支术领域本专利技术涉及一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q1()的方 法，尤其是一种利用鞘氨醇单胞菌ZUTE03 (CCTCCNO: M 207084 )发 酵萃取耦合制备辅酶Q1G的方法。
技术介绍
辅酶Qio (CoenzymeQn), CoQ1G)广泛存在于动物、才直物及孩t生物体 内，是生物细胞呼吸链中重要的递氢体，也是一种良好的生化药物(Nazzal S，Nutan M， Palamakulaa， W <a/. Optiimization of a self-nanoemulsified tablet dosage form of Ubiquinone using response surface methodology, /wferwa"'owa/ Jbw/77"/ o/jP/zarwacewf/cs, 2002, 240:103-114.)。 它具有4瓦氧4b 性、消除自由基、提高机体免疫力等功能(Ernster L. Facts and ideas about the fiinction of coenzyme Qi。 in the Mitochondria.五/serw.er^4wWeniam.1977, 23:15-18.),，已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕 金才籴症等疾病的治疗。(Jin-Ho Choi, Yeon-Woo Ryu， Jin-Ho Seo， d Biotechnological production and applications of Coenzyme Qi。' M/craWo/5z'ofec/z"o/,2005,68:9-15.)最近，研究者发现辅酶Q!。具有抗衰 老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。(张延静，袁其朋，梁浩,等.产辅酶QK)酵母的发酵条件研究.微生物学通报,2003, 30(2): 65-69.)另外，近年来科学研究表明，辅酶Qu) 对感染fflV的病人亦有辅助治疗的功效，目前这方面的应用正处于II期临床阶段(姜传福.辅酶QK)的制备及其药物功能.石油化工高等学校学报.2005， 18(4): 52—81.)。制备辅酶Qw的方法主要有动物细胞提取法、烟叶茄呢醇半合成法、完全合成法、微生物发酵法或植物细胞培养法(王青云,王发祥,钟士清，等. 微生物发酵生产辅酶Qt。的研究进展.化学与生物工程，2006, 23(8): 11-13.)。与其他方法相比，微生物发酵法具有产物活性高、原料成本低、 易控制及可实现大规模生产等特点(Meganathan R. Ubiquinone biosynthesis in microorganisms. F五MS M/cra6/o/c^ 丄e股ra， 2001， 203:131—139.)。通过发酵收集到菌体后大致通过下面两种方法来提取辅酶Qn)。 (1) 不经皂化的提取分离方法将菌体破碎后直接用丙酮或沸腾酒精抽提，后 用石油醚萃取多次，再用水或曱醇洗去极性物质，经硅胶柱纯化。(2)醇 碱或碱急化提取法用醇碱先皂化后用石油醚或正已烷回流提取，水洗后 同样经硅胶柱纯化(韩少英，窦洁，周长林.发酵法生产辅酶Qn)的研究 进展.药物生物技术，2006, 13(3): 227-232.)。同直接提取法相比，皂化后 提取法得到的提取物量较多，但辅酶Q,o容易被破坏且步骤烦瑣，费时费 力，且提取溶剂损耗较大。
技术实现思路
本专利技术即是为了对现有发酵提取工艺进行简化和优化,提供一种萃取 溶剂回收率高、方法简便、辅酶Qu)收率高的利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取 耦合制备辅酶Qw的方法。本专利技术采用的技术方案是一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Qk)的方法，所述方法 包括以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述 液体培养基添加有体积为液体培养基体积1 ~5%的大豆油，于25~28。C下培养24~36h后，加入体积为液体培养基体积0.2 0.5倍的正己烷，于 25 28。C下发酵萃取耦合6~12h,反应结束后，反应液分层取有机层，有 机层经分离纯化得到所述的辅酶Q1Q。这里在液体培养基加入大豆油作为 细胞通透剂，提高细胞膜的通透性，加正己烷作为发酵萃取试剂，在发酵 开始的同时加入发酵培养基，提高辅酶Qh)提取效率。优选的，所述鞘氨醇单胞菌种为CCTCC NO: M 207084，菌种保 藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期是 2007年6月18日，已在在先申请200710070806.8中作为新菌种予以保护。 所述大豆油体积用量优选为液体培养基体积的1.5 3°/。，更优选2%。 所述正己烷体积用量优选为液体培养基体积的7/15。 所述有机层分离纯化方法可按常规方法进行，优选的，本专利技术中有机 层分离纯化方法如下有机层于旋转蒸发仪5(TC下浓缩，冷冻析出胆固 醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qio溶液。所述液体培养基为本领域常规适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，本 专利技术中所述液体培养基优选按如下组成配制每1000 mL水中加入葡萄 糖10 20g、 (NH4)2S045 15g、 KH2P04 0.5g、 Na2HP04 1.5g、 MgSO40.5g， pH6.0 8.0 。优选的，所述方法如下以鞘氨醇单胞菌ZUTE03菌种接种于适用 于鞘氨醇属菌种的液体培养基,所述液体培养基添加有体积为液体培养基 体积2%的大豆油，于25。C下培养30h后，加入体积为液体培养基体积 7/15的正己烷，于25。C下发酵萃取耦合8h，反应结束后，反应液分层取 有机层，有机层于旋转蒸发仪50。C下浓缩至体积为原体积的1/10-1/5， 冷冻析出胆固醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qu)溶液；所述适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基按如下组成配制葡萄糖15g, (NH4)2S04 10g,KH2P04 0.5g, Na2HP04 1.5g， MgS04 0.5g,水1000 ml pH 7.0。以发酵萃取耦合法提取菌体中的辅酶Qio,首先要证明此方法对菌体 中辅酶Qw的提取不会造成损失，因此将菌体移入150ml圆底烧瓶内，分 别以传统皂化提取法和发酵萃取耦合提取法提取发酵菌体中的辅酶Q10, 每组设3组平行，所得产物溶液以HPLC进行检测分析。结果表明无论 从发酵液产量指标还是从单位菌体的产量指标分析,发酵萃取耦合提取法 相对于传统的皂化提取法，非但不会对发酵菌体中辅酶Q1G的提取造成损 失，反而能达到更高的产量。在确定以上结果的条件下，进行发酵萃取耦 合法最优条件的单因素研究。根据以上发酵萃取耦合的方法，对细胞通透剂的选择、通透剂添加浓 度、通透剂添加时间、发酵萃取耦合溶剂选择、萃取溶剂添加量、添加时 间及萃取时间等工艺条件分别进行了优化。最终确定以大豆油为细胞通透 剂，发酵起始时加入大豆油作为细胞通透剂，添加体积为液体培养基体积 的2 %，以正己烷为萃取溶剂，发酵30h后加入液体培养基体积7/15的 量，发酵萃取耦合8h,提取所得的辅酶QK)的产量最高能达到32.51mg/L。以上方法省去了辅酶本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Ｑ↓［１０］的方法，所述方法包括：以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积１～５％的大豆油，于２５～２８℃下培养２４～３６ｈ后，加入体积为液体培养基体积０．２～０．５倍的正己烷，于２５～２８℃下发酵萃取耦合６～１２ｈ，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层经分离纯化得到所述的辅酶Ｑ↓［１０］。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：钟卫鸿，方建军，柳华贵，钟莉，李炎生，李艺潇，汪新，张艾晓，
申请(专利权)人：浙江工业大学，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]
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