提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法技术

本发明专利技术是一种生物技术领域的提高长春花毛状根ＴＩＡｓ含量的方法。本发明专利技术从长春花中克隆ｓｔｒ和ｇ１０ｈ基因，构建含ｓｔｒ和ｇ１０ｈ基因的植物表达载体，遗传转化长春花获得转基因长春花毛状根，高效液相色谱法测定长春花毛状根中ＴＩＡｓ含量，荧光定量ＰＣＲ测定长春花毛状根ＴＩＡｓ生物合成相关基因的表达。本发明专利技术获得的转基因长春花毛状根中重要ＴＩＡｓ［抗癌药物长春碱（Ｖｉｎｂｌａｓｔｉｎｅ）、长春新碱（Ｖｉｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）］的含量显著提高，其中长春碱含量比非转化对照根提高了２３４倍，从而提供了一种提高长春花毛状根ＴＩＡｓ的方法，也为生产具重要临床需求的抗癌药物长春碱和长春新碱提供了一种新方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及的是一种生物
的方法，特别是一种双关键酶基因共转化代谢工程策略提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱(TIAs)含量的方法。
技术介绍
长春花(Catharanthus roseus)是夹竹桃科(Apocynaceae)长春花属植物，目前人们从长春花全草中分离了100多种萜类吲哚生物碱(Terpenoid indolealkaloids，TIAs)，如长春碱(Vinblastine)、长春新碱(Vincristine)、阿吗碱(Ajmalicine)、蛇根碱(Serpentine)、文多灵碱(Vindoline)、长春质碱(Catharanthine)、洛克定碱(Lochneridine)、派文利碱(Perivine)等。大多数TIAs由于具有生物学活性而被广泛应用于现代医药中，如著名的抗肿瘤药物长春碱和长春新碱可用于治疗何杰金氏病、恶性淋巴肿瘤、急性淋巴细胞型白血病、绒毛上皮细胞癌及其它癌症，其硫酸盐已广泛用于临床，是目前应用最广的天然植物抗肿瘤药物。长春花中其它TIAs，如阿吗碱和蛇根碱是高效降压药，文多灵、长春质碱和环氧长春碱(Leurosine)具降血糖作用，可治疗糖尿病，文多灵和长春质碱是降血脂药。长春碱和长春新碱是目前长春花中药用价值最大、应用最广泛的抗癌TIAs。它们主要是从天然长春花植株中提取，但天然植物体内含量极其微少，使得长春花材料来源困难。长春花中长春碱和长春新碱的含量还受到植株发育阶段、细胞分区、组织分化和环境的影响，仅从天然植物中提取TIAs远远不能满足市场需求。长春碱和长春新碱由于结构复杂，化学合成和半合成成本太高，不具商业前景。毛状根和细胞培养系统为生产这些有价值的生物碱带来了希望。尽管通过毛状根和细胞培养系统能产生单萜类吲哚生物碱阿吗碱，但其含量太低不具商业前景，且细胞培养系统不能产生最具应用价值的双萜类吲哚生物碱长春碱和长春新碱。因此，提高植物生物碱含量和改变生物碱组成成份是非常必要的。代谢工程为改变植物细胞或毛状根的组成成份和增加植物细胞或毛状根生物碱产量提供了一条诱人的方法。为了更有效地生产长春花生物碱，开展TIAs生物合成途径及其催化酶乃至基因的表达与调控研究，以及开展TIAs代谢工程研究将提高TIAs含量并最终解决抗肿瘤TIAs药物稀缺的有效方法。经检索发现，现有文献中香叶醇-10-脱氢酶(Geraniol 10-hydroxylase，G10H)和异胡豆苷合成酶(Strictosidine synthase，STR)是长春花TIAs生物合成途径中的关键酶，是TIAs代谢工程的重要靶点。采用基因工程手段，将所述的两个关键酶基因str和g10h共转化长春花，将打破TIAs生物合成限速瓶颈，获得长春花TIAs高产的长春花毛状根或植株，为规模化生产长春花TIAs提供一条新途径，但尚未发现与本专利技术主题所提及的双关键酶基因共转化策略提高长春花毛状根TIAs含量的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种。本专利技术涉及的关键酶基因克隆、载体构建、遗传转化、分子检测、TIAs提取及含量测定、荧光定量PCR分析用于本专利技术，建立了提高长春花毛状根TIAs含量的方法，为长春花毛状根大规模工厂化生产奠定坚实的基础，促进了我国长春花药物
的发展。本专利技术是通过以下技术方案实现的本专利技术从长春花中克隆str和g10h基因，构建含所述DNA分子的植物表达载体，用发根农杆菌介导，将str和g10h基因同时导入长春花细胞并再生出毛状根；PCR和荧光定量PCR检测外源目的基因str和g10h的整合和表达情况，高效液相色谱测定长春花毛状根中TIAs含量。本专利技术包括如下具体步骤(1)采用基因克隆方法获得长春花关键酶基因str和g10h；(2)把str和g10h基因可操作性地连于表达调控序列，形成含str和g10h基因的植物表达载体；(3)将含str和g10h基因的植物表达载体转化发根农杆菌，获得用于转化长春花的含str和g10h基因植物表达载体的发根农杆菌菌株；(4)利用所构建的发根农杆菌菌株转化长春花细胞，获得经PCR检测的转基因毛状根；(5)荧光定量PCR测定长春花毛状根中TIAs生物合成相关基因的表达； (6)对获得的转基因毛状根中TIAs含量进行高效液相色谱法测定，获得TIAs含量显著提高的转基因长春花毛状根。所述的PCR检测中，分别设计合成rolB、rolC、hpt、str和g10h基因的引物，进行DNA扩增，紫外线下观察到目的条带的阳性株系即为转基因长春化毛状根。所述的高效液相色谱测定阿吗碱、长春碱和长春新碱含量的方法如下色谱柱C-18反相硅胶柱，流动相乙腈∶磷酸缓冲液，体积比为25∶75，检测波长220nm，柱温30℃，流速1.0mL/min，进样量10μL，灵敏度为AUFS＝1.0，理论塔板数按长春碱、长春新碱和阿吗碱峰计算≥2000。所述的荧光定量PCR测定长春花毛状根中TIAs生物合成相关基因的表达的方法为分别设计合成长春花TIAs生物合成途径中的11个基因和看家基因18SrRNA的引物，进行荧光定量PCR扩增，用相对定量法分析基因相对表达量。本专利技术的双关键酶基因共转化策略提高长春花毛状根TIAs含量的方法，采用基因工程方法，将双关键酶基因导入长春花毛状根中，获得了TIAs高产的长春花毛状根无性系。TIAs高产长春花毛状根的获得，可以显著增加长春花毛状根中重要抗癌TIAs的含量，毛状根中长春碱、长春新碱和阿吗碱的含量分别是非转化对照根的234.8倍、3.3倍和40.6倍，对解决抗癌TIAs药源匮乏、满足医药工业大规模工厂化生产需要具有重要意义。具体实施例方式下面结合具体实施例进一步阐述本专利技术。应理解为这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例1长春花str和g10h基因的克隆1.组织分离(Isolation)将长春花种子用75％乙醇浸泡1min，再用2％NaClO浸泡10min，无菌水冲洗3-4次，用无菌吸水纸吸干表面水分，接种于无激素的MS(Murashige and Skoog，1962)固体培养基中，25℃、12h/12h光照培养，即可获得长春花无菌苗，待苗长至5cm左右后，切取叶片和茎段用于RNA提取。2.RNA的分离(RNA isolation)称取0.5g所述的长春花无菌试管苗，用液氮速冻后，迅速用研钵研碎，加入盛有1mL TRIzol(TRIzol Reagents，GIBCO BRL，USA)的1.5mL Eppendorf管中，充分振荡后，于室温下放置5min，加200μL氯仿，用力振荡15sec，室温放置2-3min后，于4℃、12,000g离心15min；将上清液(约600μL)吸入干净的1.5mL Eppendorf管中，加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温下放置10min后，于4℃、12,000g离心10min；弃上清，加1mL 75％乙醇清洗，振荡后，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种提高长春花毛状根萜类吲哚生物碱含量的方法，其特征在于，从长春花中克隆ｓｔｒ和ｇ１０ｈ基因，构建含所述ＤＮＡ分子的植物表达载体，用发根农杆菌介导，将ｓｔｒ和ｇ１０ｈ基因同时导入长春花细胞并再生出毛状根，ＰＣＲ和荧光定量ＰＣＲ检测外源目的基因ｓｔｒ和ｇ１０ｈ的整合和表达情况，高效液相色谱测定长春花毛状根中ＴＩＡｓ含量。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，龚一富，廖志华，苗志奇，孙小芬，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]