一种生物传感器及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种生物传感器及其应用。本发明专利技术提供的一种ＤＮＡ片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动子和报告蛋白的编码基因；所述调节基因为编码如下（ａ）或（ｂ）所示蛋白的基因：（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（ｂ）将序列表中序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由（ａ）衍生的蛋白质。实验证明，本发明专利技术的传感器，在厌氧条件下能高效、特异和灵敏地检测丁醇，既可定性又可半定量，借助流式细胞仪、荧光显微镜以及酶标仪等仪器，实现了从大量微生物样品中高通量筛选产丁醇微生物或产丁醇能力强微生物，缩短和简化了筛选过程，解决了目前丁醇检测手段的费时、繁琐等缺点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物传感器及其应用。
技术介绍
丁醇是一种重要的化工原料，有多种用途，如用于制造邻苯二甲酸二丁酯和脂 肪族二元酸丁酯类增塑剂，用于各种塑料和橡胶制品的生产。丁醇还可用来生产丁 酸、丁酸、丁胺和醋酸丁酯，它们可用作树脂、油漆、粘接剂的溶剂，也可用作油 脂、药物和香料的萃取剂及醇酸树脂涂料的添加剂。近年来美国科学家的研究表明， 丁醇还是一种极具潜力的新型生物燃料。与甲醇和乙醇相比，丁醇在性能上与汽油 更为接近，这就更加引起了研究者和企业对其的研究开发兴趣。丁醇可由化学合成法和发酵法生产。化学合成法主要包括两条路线， 一是以丙 烯为原料，经羰基合成法生成正、异丁醛，加氢后分馏得到正丁醇；二是以乙醛为 原料，经醇醛縮合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得到正丁醇。丙烯和乙 醛主要来自于石油等不可再生资源，不利于节约资源，因此，化学合成法的推广受 到了资源限制。进入21世纪后，随着全球石油等不可再生资源的价格迅速上涨以及绿色化学 理念的提出，发酵法生产丁醇工艺由于原料来源广泛等优点又重新受到重视。目前 工业中用于发酵生产丁醇的菌的生产能力和耐受性还都比较低，需要筛选出新型高 产的产丁醇微生物。目前检验微生物产丁醇的能力一般需要扩大培养，再进行气相 或液相检测，这一系列过程都很繁琐，耗时耗力。因此，筛选产丁醇微生物的关键 是建立一套快速、有效检测丁醇存在的技术。全细胞传感器是一种利用完整活细胞 为载体，能够连续检测和分析细胞在外界刺激下的生理性能，定性定量测定物质信 息(如确定该类物质的存在与否以及浓度大小等)的检测器。与酶传感器相比，全 细胞传感器应用范围更广，检测标准和提供的信息更多，更能准确地反应被分析物 的信息；其次，全细胞是一个严谨调控的系统，能够稳定修复整合酶活性，产生的 信号强而且重复性好；另外，全细胞传感器在环境毒性化合物检测方面弥补了气相 和液相等传统检测方法的不足；尤为重要的是，全细胞传感器的检测酶为胞内酶， 不存在酶的纯化、酶活性保持以及失活等问题。因此，全细胞传感器在有机化合物检测方面得到了更为迅速的发展。微生物全细胞传感器的最大特点就是能够检测天然环境中可供生物利用的痕量物质。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种DNA片段。本专利技术所提供的DNA片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动 子和报告蛋白的编码基因；所述调节基因为编码如下(a)或(b)所示蛋白的基因(a) 由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质；所述报告蛋白为如下(1)或(2)所示的蛋白-(1) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(2) 将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由(1)衍生的蛋白质。为了使上述(a)或(1)中的蛋白便于纯化，可在由序列表中序列2或序 列l所示的氨基酸序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表l 所示的标签。表l、标签的序列<table>table see original document page 5</column></row><table>上述(a) 、 (b) 、 (1)或(2)中的蛋白可人工合成，也可先合成其编码基 因，再进行生物表达得到。上述(b)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列3 所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱 基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到； 上述(2)中的蛋白的编码基因可通过将序列表中序列4所示的DNA序列中缺失一 个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5'端和/或3'端连上表1所示的标签的编码序列得到。本专利技术所提供的DNA片段中，所述调节基因可为如下(c) 、 (d)或(e)所示的基因(c) 其核苷酸序列是序列表中序列4所示DNA分子；(d) 在严格条件下与(c)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(e) 与(c)限定的DNA序列有9(W以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述报告蛋白的编码基因可为如下(3) 、 (4)或(5)所示的基因(3) 其核苷酸序列是序列表中序列3所示DNA分子；(4) 在严格条件下与(3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；(5) 与(3)限定的DNA序列有90。/。以上同源性且编码所述蛋白的DNA分子； 所述丁醇特异性启动子的核苷酸序列可为如下I 、 II、 III或IV所示I至少含有序列表中序列5中自5'末端第148-198位核苷酸的DNA分子； II其核苷酸序列是序列表中序列5所示DNA分子；III在严格条件下与I或II限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子； IV与I或II限定的DNA序列有90%以上同源性且具有相同功能的DNA分子。 所述严格条件可为在O.lxSSPE(或O.lxSSC)， 0.1。/。SDS的溶液中，在65°C下杂交，并用该溶液洗膜。含有上述任一所述DNA片段的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒也属 于本专利技术的保护范围。本专利技术的另一个目的是提供一种生物传感器。本专利技术所提供的生物传感器，包括含有上述任一所述DNA片段的重组菌或转基 因细胞系。一般情况下，本专利技术的生物传感器与荧光显微镜等物理器件联合使用。 其中，所述菌可为大肠杆菌、枯草芽胞杆菌。上述生物传感器在检测丁醇中的应用也属于本专利技术的保护范围。具体可用于环 境样品(如土壤、污水等)中丁醇的定性和定量检测。上述生物传感器在筛选丁醇产生菌中的应用也属于本专利技术的保护范围，如可应 用于从环境样品中筛选能产生丁醇的菌株、从经诱变等处理的突变菌株库中筛选产 丁醇能力比出发菌株强的菌株等。本专利技术的最后一个目的是提供一种报告蛋白及其编码基因。本专利技术所提供的蛋白，是如下(a)或(b)的蛋白质(a) 由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b) 将序列表中序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或 缺失和/或添加且具有相同功能的由(a)衍生的蛋白质。上述报告蛋白在制备生物传感器中的应用及上述报告蛋白的编码基因在制备 生物传感器中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术是将本专利技术报告蛋白的编码基因与丁醇特异性表达基因的启动子序列 相连，得到融合基因，再将融合基因导入宿主菌中，得到生物传感器，该传感器能 特异的检测丁醇。在实际应用中，还可以将本专利技术报告蛋白的编码基因与其它对某 物质具有特异性表达的基因的启动子相连，从而制备检测该物质的生物传感器。生物传感器通常采用绿色荧光蛋白作为报告蛋白，这种传感器适用于单细胞检 测，而且表型更为直观。然而绿色荧光蛋白形成生色团过程严格需要辅因子分子氧 参与，这种缺陷就制约了生物传感器在厌氧条件下的应用。本专利技术的来源于 尸se"A/z/朋i'a尸WiA的报告蛋白，其在厌氧和好氧条件下均能依赖黄素单核苷酸 产生荧光，因此，由其所构建的传感器即使在厌氧条件下也能保证荧光信号分子本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ片段，其自上游至下游依次为调节基因、丁醇特异性启动子和报告蛋白的编码基因；　所述调节基因为编码如下（ａ）或（ｂ）所示蛋白的基因：　（ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；　（ｂ）将序列表中序列２的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由（ａ）衍生的蛋白质；　所述报告蛋白为如下（１）或（２）所示的蛋白：　（１）由序列表中序列１所示的氨基酸序列组成的蛋白质；　（２）将序列表中序列１的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且具有相同功能的由（１）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：贾开志，李寅，张延平，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]