一种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途技术

本发明专利技术提供了一种促红细胞生成素来源肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明专利技术还提供了上述促红细胞生成素来源肽的制备方法。还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗治疗神经细胞损伤的药物中的应用。还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗缺氧性脑损伤的药物中的应用。还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗癫痫的药物中的应用。本发明专利技术的新型EPO来源肽，该新药分子量小、能透过血脑屏障，且其是来源于人体内功能蛋白的小分子多肽，较其它研制合成的药物而言，对人体副作用极小，临床应用前景可观。该发明专利技术应用于临床，将成为预防和治疗中枢神经系统疾病新型的神经保护药物，为神经损伤患者提供新的治疗方向。

A erythropoietin source peptide and its preparation methods and uses

【技术实现步骤摘要】
一种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途
本专利技术属于生物基因领域，涉及一种促红细胞生成素，具体来说是一种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途。
技术介绍
随着人类寿命的延长，神经系统疾病正越来越成为患者、家人和社会的沉重负担。2016年《柳叶刀》杂志发表了国际疾病负担组(GBD)新的全球死因分析报告，2015年脑血管病死因顺位再次上升，跃升为人类死因的第二位。而在我国，脑血管疾病是我国人口首位的死亡原因和致残原因，其患病率逐年上升，并有年轻化的趋势。而阿尔兹海默病、其他类型痴呆、癫痫、帕金森病等其它神经系统疾病的发病率也是逐年上升，其死亡人数从1990年到2015年增长率超过20％。除了影响健康，以脑血管疾病为代表的神经系统疾病给国家和社会造成了一定的经济负担，WHO计算得出，减少10％的卒中和心肌梗死所致的死亡率，预计每年会减少用于干预措施的约250亿美元的经济支出。从某种意义上说，神经系统疾病不仅是医学问题，也是社会问题。神经系统疾病由于发病机制复杂，症状繁多，仍有不少尚缺乏有效的药物治疗。比如缺氧性脑病，高压氧舱可以改善脑组织供氧，但禁用于控制不佳的高血压患者和危重患者，且可能产生脑血管继发性收缩而引起的不良作用，临床应用受到限制。再比如缺血性卒中，脑缺血后发生能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用等一系列病理生理改变，溶栓是目前唯一有效的方法，但溶栓治疗时间窗较短，只有少数患者受益。另一方向则是神经保护治疗，阻断神经细胞的死亡，挽救缺血半暗带的神经细胞。目前可能具有保护作用的主要神经保护剂有：谷氨酸拮抗剂、抗炎因子、钙离子通道阻断剂、钠离子通道阻断剂、钾离子通道激活剂、自由基清除剂、GABA受体拮抗剂、5-羟色胺拮抗体、NMDA受体拮抗剂、低温苯巴比妥类药物诱导麻醉等。当前有超过1000多个神经保护剂，在动物实验中有效，超过100种药物进行了临床试验，然而在临床上却收效甚微。因此研制和开发在新的有效的神经保护剂有重要意义。促红细胞生成素(EPO)是主要由肾脏产生的由165个氨基酸组成的34kDa的糖蛋白激素，是最早应用于临床的细胞因子。以往促红细胞生成素在临床被广泛应用于治疗贫血，近年来研究发现，EPO及EPO受体(EPOR)还广泛分布于各种非造血组织，包括神经、心脏、肾脏等，是一种多功能分子，具有广泛的组织保护活性。特别地，近20年来的研究发现，无论在体内或体外实验，EPO均可起到神经保护和神经营养作用。在神经系统，EPO/EPOR表达在神经元、星形胶质细胞、血管内皮细胞等，在正常成人脑组织内EPO/EPOR呈低表达状态，但当受到损伤或缺血、缺氧等应激时其表达显著增加。但激活的EPO/EPOR系统尚不足以保护受损的神经细胞，而若外源性补充大量重组促红细胞生成素(rhEPO)，通过细胞膜上的受体介导的胞吞或胞饮作用透过血脑屏障进入神经系统，EPO与过度表达的EPOR结合后诱导Jak2磷酸化，激活信号转导子及转录激活子STAT5通路、磷脂酰肌醇3激酶(P13K)/AKT通路、核因子NF-κB等多个通路，通过抗炎、抗氧化应激、抗凋亡、抑制兴奋性毒性、促进神经再成、保护血脑屏障等多种机制联合作用，减少神经细胞的凋亡，减轻神经元的损伤，发挥神经保护作用。并且，EPO的神经保护作用已在多种动物疾病模型中证实，包括：脑缺血、脑缺血缺氧性损伤、脑缺血再灌注损伤、脊髓损伤、实验性自身免疫性脑脊髓膜炎(EAE)、蛛网膜下腔出血、癫痫、帕金森、多系统萎缩、坐骨神经压迫、视网膜神经节损伤等。随着EPO在体内外实验均被证实具有神经保护作用后，最近十几年，一系列的临床试验进一步研究EPO是否在人体内可以发挥神经保护及再生的功能，从脑缺血、神经损伤到炎症及神经退行性变患者，比较欣慰的是，这些研究大多证实了EPO的治疗是有效的。但大剂量或长期使用EPO，由于其具有促进红细胞生成的作用，会直接导致红细胞增多症、高血压、血栓形成等一系列严重的医学问题，因此，研发无造血功能但具有神经保护功效的EPO衍生物、变构体等制剂，成为目前神经科学家研究的热点。近年来，研究者相继开发了一些具有神经保护作用但无促红细胞生成作用的EPO衍生物，一类是以氨甲酰化EPO(CEPO)为代表，包括去唾液酸EPO(asialoEPO)和低唾液酸EPO(Neuro-EPO)等的对促红细胞生成素蛋白修饰的衍生物。且随着对EPO及CEPO研究的深入，发现CEPO不与EPOR结合，但还能保留EPO的神经保护和其它组织保护作用。因而进一步提出，不同于EPO的促红作用是由2分子的EPOR所形成的二聚体所介导，EPO所发挥的组织保护作用包括神经保护作用则是由EPOR与CD131即βcR(β共同体)组成的异聚体所介导。另一类衍生物是模拟EPO空间结构的小分子多肽，包括HBP、HBSP(ARA290)、pHBSP、EpopeptideAB、MKX-2、JM4、Epotris等。这一类多肽衍生物具有分子量小，易透过血脑屏障的优点，临床应用前景可观，但仍需进一步深入研究及试验于临床验证其在人体内的作用。
技术实现思路
针对现有技术中的上述技术问题，本专利技术提供了一种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途，所述的这种促红细胞生成素来源肽及其制备方法和用途要解决现有技术中的EPO作为神经保护作用后，由于其具有促进红细胞生成的作用，会直接导致红细胞增多症、高血压、血栓形成等一系列严重的医学问题的技术问题。本专利技术提供了一种促红细胞生成素来源肽，其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。具体为：SEAVLRGQALLVNSSPLQLHVDAVSGLASLTTLLRAL。进一步的，所述的结构式如下：本专利技术还提供了上述促红细胞生成素来源肽的制备方法，包括如下步骤：1)采用亮氨酸为起始树脂，然后用DMF(N,N-二甲基甲酰胺)浸泡树脂20～50分钟，然后用脱帽液去除FMOC(芴甲氧羰基)，20～50分钟后用二甲基甲酰胺清洗；2)加入下一个氨基酸、缩合剂和碱，反应20～50分钟，再用二甲基甲酰胺清洗检测，检测通过后用脱帽液去除笏甲氧羰基，30分钟后再用二甲基甲酰胺清洗；3)再按设计好的序列接下一个氨基酸，直到接至最后一个氨基酸。进一步的，步骤2)中的氨基酸为丙氨酸。进一步的，步骤3)中的氨基酸为精氨酸。进一步的，所述的缩合剂为TBTU即O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯。进一步的，所述的碱为吗啡啉。进一步的，所述的脱帽液为六氢吡啶和N,N-二甲基甲酰胺1:4组成的混合液。本专利技术还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗治疗神经细胞损伤的药物中的应用。本专利技术还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗缺氧性脑损伤的药物中的应用。本专利技术还提供了上述促红细胞生成素来源肽在制备治疗癫痫的药物中的应用。本专利技术首先参考公开的人类EPO氨基酸序列(Proteomicdatabases，P01588)，根据1998年Nature杂志(Nature,1998.395(6701):p.511-6)上公开的研究结果，选取了其中一段包含有EPO与EPOR结合位点及EPO蛋白螺旋结构的氨基酸序列，并对部分氨基酸进行缺失，将原来位于第103位的精氨酸，替换为丙氨酸，设计为全新的EPO来源肽序列SEA本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促红细胞生成素来源肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种促红细胞生成素来源肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。2.根据权利要求1所述的一种促红细胞生成素来源肽，其特征在于：其结构式如下：3.权利要求1所述的一种促红细胞生成素来源肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：1)采用亮氨酸为起始树脂，然后用N,N-二甲基甲酰胺浸泡树脂20～50分钟，然后用脱帽液去除芴甲氧羰基，20～50分钟后用二甲基甲酰胺清洗；2)加入丙氨酸、缩合剂和碱，反应20～50分钟，再用二甲基甲酰胺清洗检测，检测通过后用脱帽液去除芴甲氧羰基，30分钟后再用二甲基甲酰胺清洗；3)再按设计好的序列接下一个氨基酸精氨酸，直到接至最后一个氨基酸。4.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：汪昕，丁晶，吴婷婷，
申请(专利权)人：复旦大学附属中山医院，
类型：发明
国别省市：上海,31