三组件嵌合的反义寡核苷酸制造技术

一种嵌合的反义寡核苷酸，它包含：一个５′端；一个３′端；以及１１－５９个５′到３′连接的核苷酸，这些核苷酸独立选自２′－脱氧硫代磷酸酯核苷酸、２′－修饰的硫代磷酸酯核苷酸、２′－修饰的磷酸二酯核苷酸、２′－修饰的Ｐ－烷氧基磷酸三酯核苷酸，其中： ａ）所述寡核苷酸掺入了ＲＮＡ酶Ｈ激活区，该激活区有３－１２个无隔的２′－脱氧硫代磷酸酯连接的碱基； ｂ）最５′端的５′到３′核苷酸键是硫代磷酸酯键或Ｐ－烷氧基磷酸二酯键； ｃ）最３′端的５′到３′核苷酸键是硫代磷酸酯键或Ｐ－烷氧基磷酸二酯键，或３′端被封闭；和 ｄ）寡核苷酸含有不超过１２个无隔的２′－脱氧硫代磷酸酯键。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】本申请要求了美国专利申请No.60/026,732(1996年9月26日提交)和08/754,580(1996年11月21日提交)的优先权。1.专利
本专利技术涉及反义寡核苷酸，该寡核苷酸的靶标是细胞内作为细胞酶RNA酶H底物的mRNA，从而使所靶向的mRNA特异性降解。该寡核苷酸有四个组件RNA酶H激活区；互补区；5′末端和3′末端。本专利技术优化了每个组件，以抗胞内核酸酶，提高与靶mRNA的杂交，特异性地灭活细胞中的靶mRNA，并降低胞毒性。2.专利技术背景反义多核苷酸可用来特异性地抑制哺乳动物细胞内不需要基因的表达。它们可用来与RNA分子(通常是信使RNA)杂交，并通过激活的RNA酶H来抑制RNA分子的功能。反义寡核苷酸应用的出现为治疗某些疾病提供了一种有效的新方法。迄今绝大部分工作侧重于反义寡核苷酸作为抗病毒剂或抗癌剂的应用(Wickstrom，E.编辑，Prospects for antisense Nucleic Acid Therapy of Cancer and AIDS，New YorkWiley-Liss，1991；Crooke，S.T.和Lebleu，B.编辑，Antisense Research andApplication，Boca RatonCRC Press，1993，pp.154-182；Baserga，R.和Denhardt，D.T.，1992，Antisense Strategies，New YorkThe New York Academy of Sciences，Vol.660；Murray，J.A.H.，编辑，Antisense RNA and DNA，New YorkWiley-Liss，1993)。已发表了许多将反义寡核苷酸用作抗病毒剂的文献。例如，Agrawal等报道了用亚磷酰胺寡核苷酸和硫代磷酸酯寡核苷酸作为HIV的反义抑制剂。Agrawal等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 857079-7083(1988)。Zamecnik等公开了用反义寡核苷酸作为鸡成纤维细胞中Rous肉瘤病毒复制的抑制剂。Zamecnik等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 834143-4146(1986)。反义寡核苷酸影响所靶向RNA分子的主要机制是通过激活能断裂DNA/RNA杂交体中的RNA链的细胞酶RNA酶H。磷酸二酯和硫代磷酸酯连接的DNA可激活内源RNA酶H，从而使所靶向的RNA断裂(Agrawal，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871101-5(1990)；Woolf，T.M.，等，Nucleic Acids Res.181763-9(1990))。然而，连接磷酸二酯的DNA会被细胞核酸酶迅速降解，连接硫代磷酸酯的DNA则例外，能抵抗核酸酶，非天然存在的DNA衍生物在与RNA杂交时不会激活RNA酶H。尽管连接硫代磷酸酯的DNA有激活RNA酶H的优点，但是它与非特异性胞毒效应有关而且对RNA亲和力较低(Stein，C.A.等，Aids ResHum Retroviruses 5639-46(1989)；Woolf，T.M.等，Nucleic Acids Res.181763-9(1990)；Kawasaki，A.M.，等，J.Med.Chem.36831-41(1993))。用具有硫代磷酸酯DNA短延伸序列(3-9个碱基)的嵌合反义寡聚物实现了RNA酶H介导的RNA靶断裂(Dagle，J.M.，等，Nucleic Acids Res.184751-7(1990)；Agrawal，S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871401-5(1990)；Monia，B.P.等，1993，J.Biol.Chem.26814514)。激活细菌RNA酶H最少需要3个DNA碱基(Futdon，P.J.等，Nucleic Acids Res.179193-9204；Quartin，R.S.，等，Nucleic Acids Res.177235-7262)，而激活哺乳动物RNA酶H则最少需要5个碱基(Monia，B.P.等，J.Biol.Chem.26814514-14522(1993))。在这些嵌合寡核苷酸中有一个形成RNA酶H底物的中心区域，该区域侧接了杂交“臂”，该杂交“臂”包含不形成RNA酶H底物的经修饰的核苷酸。另外，已经报道了采用含RNA酶H的HeLa细胞抽提物的胞外试验，其中RNA酶H激活区在寡聚物的5′或3′侧。这些试验具体地报道了由磷酸二酯2′-脱氧核苷酸组成的、连接到与甲基膦酸酯连接的互补区上的5′或3′端的RNA酶H激活区域有全部活性，但由硫代磷酸酯2′-脱氧核苷酸组成的、连接到与甲基膦酸酯连接的互补区上的5′端的RNA酶H激活区只有部分活性。参见Col 10，美国专利No.5,220,007(T.Pederson等)。现已采用2′-O-甲基或2′-氟代修饰的寡核苷酸作为嵌合寡聚物的杂交臂。Inoue，H.，等，1987，Nucleic Acids Res.156131-48。2′-O-甲基基团提高了寡聚物对所靶向RNA的亲和力，并且提高了寡聚物在细胞培养中的活性。然而，具有磷酸二酯键的2′-O-甲基碱基会被外切核酸酶降解，因此它不适用于反义寡核苷酸在细胞内的应用或治疗应用。Shibahara，S.，等，1989，Nucleic Acids Res.17239-52。如硫代磷酸酯均一修饰的寡聚物(Monia B.P.，等，1993，J.Biol.Chem.26814514-14522)和末端用硫代磷酸酯取代的2′-O-甲基核糖-寡核苷酸(Shibahara，S.，等，1989，Nucleic Acid Res.17239-252)中显示的，硫代磷酸酯2′-O-甲基核苷酸有抗核酸酶的能力。然而，硫代磷酸酯完全取代的寡聚物可能会引起非特异性的效应，包括细胞毒性。Stein，C.A.，等，1989，Aids Res.Hum.retrov.5639-646；Woolf，T.M.，等，1990，Nucleic Acids Res.181763-69；Wagner，R.W.，1995，Antisense Res.Dev.5113-115；Krieg，A.M.，&Stein，C.A.1995，Antisense Res.Dev.5241。在Crooke，S.T.等，1995，Bioch.J.312599-608和Iwai，S.等，1995，FEBS Lett(Neth.)368315-20中讨论了2′-氟代寡核苷酸对细菌RNA酶H的作用。已经用其它几种化学物质来制作非RNA酶H底物的嵌合寡聚物的“臂”或区域。第一种嵌合寡聚物在臂中采用的是甲基膦酸酯或亚磷酰胺键(Dagle，J.M.，Walder，J.A.&Weeks，K.L.，Nucleis Acids Res.181751-7(1990)；Agrawal，S.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871041-5(1990)。尽管这些化合物在缓冲系统和非洲爪蟾卵母细胞中有很好的作用，但是臂会降低杂交亲和力。亲和本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：托德·M·伍尔夫，A·阿罗，R·M·K·戴尔，
申请(专利权)人：奥利哥斯ETC股份有限公司，托德·M·伍尔夫，
类型：发明
国别省市：