高催化活性的D‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术提供酶活性显著提高的新的FSAA突变体及其核苷酸序列，以及含有相应突变体基因的重组表达载体和基因工程菌，通过这些FSAA突变体或含有相应突变体蛋白的基因工程菌不对称催化噻吩‑2‑甲醛、噻吩‑3‑甲醛、苯并噻吩‑2‑甲醛、糠醛、吡啶‑2‑甲醛中的一种和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应可制备高光学纯度的手性产物，催化活性高，产物光学纯度高。

The high catalytic activity of D fructose 6 aldolase A mutant, recombinant expression vector, gene engineering bacteria and its application

The present invention provides novel FSAA mutant enzyme activity was significantly increased and its nucleotide sequence, and contains the corresponding mutant gene recombinant expression vector and gene engineering bacteria, through these FSAA mutants or mutants containing the corresponding protein gene engineering bacteria 2 formaldehyde catalytic asymmetric thiophene and thiophene 3 formaldehyde, benzothiophene 2 formaldehyde 2, furfural, pyridine formaldehyde in a and hydroxyacetone (HA) of the aldol reaction can be chiral product prepared with high optical purity, high catalytic activity, high optical purity of products.

【技术实现步骤摘要】
高催化活性的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用
本专利技术属于基因工程与酶工程领域，具体涉及D-果糖-6-磷酸醛缩酶A的分子改造，获得突变体、重组表达载体，基因工程菌以及不对称催化噻吩-2-甲醛及类似物和羟基丙酮(HA)的羟醛缩合反应以制备光学活性产物中的应用。
技术介绍
不对称直接羟醛缩合反应是一类非常重要的C-C加成反应。其产物为天然多羟基化合物或全新的多羟基小分子。由于羟基能够轻易被转换为多种其他功能基团，这些多羟基小分子成为最重要的手性砌块之一，尤其是在医药领域具有重要的应用价值。例如，噻吩-2-甲醛(1a)的衍生物Duloxetin用于抑郁症的治疗，以及苯并噻吩-2-甲醛(1c)的衍生物苯并噻吩多羟基醇可与天然核苷酸间形成氢键而结合，从而具备作为分子诊断探针的潜力。相应的醛受体(1)与羟基丙酮(HA,2)通过羟醛缩合生成的1,2-二醇(3)可作为上述医药化合物的重要手性前体。当前3的合成路径主要依赖于化学催化的噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA的羟醛缩合反应。涉及到的催化剂为L-脯氨酸衍生物或α-氨基酸胺类衍生手性离子液体(α-aminoacidamides-derivedchiralionicliquid)，转化率相对较高，但是前者立体选择性不足，后者催化剂价格昂贵、合成复杂。由于该反应生成了两个新的功能性手性中心，对该反应手性化学的绝对控制显得尤为重要，同时需要考虑反应的方便性和经济性。因此，噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA缩合的高立体选择性及廉价易得的催化剂是化学催化该反应的主要障碍。从另一方面而言，生物催化因具有催化效率高、选择性好、副产物少、反应条件温和同时廉价易制备等优点而成为绿色化学合成的优选途径。这其中，醛缩酶作为一类能够天然催化羟醛缩合反应的催化剂，具有很高的催化效率和立体选择性，且来源广、易于制备和操作，因此可作为首选催化剂。在具有催化不对称直接羟醛缩合反应能力的醛缩酶中，D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)能够以非磷酸化的羟基丙酮(HA)、二羟基丙酮(DHA)和羟基丁酮(HB)作为底物，而非相对昂贵且制备较为繁琐的磷酸二羟基丙酮(DHAP)，后者是DHAP依赖型醛缩酶的催化底物。此外，FSAA催化产物具有很高的光学纯度，因此该酶一经报道便获得了广泛的关注。专利技术人所在课题组前期以野生型FSAA(WT)催化噻吩-2-甲醛及类似物(1)和HA的羟醛缩合反应，发现催化效率低下，WT的活力远不能满足工业化生产要求，因此，有必要通过理性设计的手段提高该酶的催化效率以充分挖掘其应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是首次以酶分子作为生物催化剂的噻吩-2-甲醛及其类似物与HA间的羟醛缩合反应，此外为这些反应提供强有力的生物催化剂，即酶活提高的FSAA的突变体及其重组大肠杆菌。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供一种催化活性显著提高的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A(FSAA)的突变体。这些突变体是在SEQIDNo:2所示醛缩酶FSAA氨基酸序列基础上进行构建，该醛缩酶核苷酸序列如序列表中SEQIDNo:1所示。具体的，所述突变体选自a或b：a.在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列基础上含有以下单个位点突变:31位异亮氨酸、163位亮氨酸及195位异亮氨酸；b.在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列基础上含有以下两个或两个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。所述突变体是分别在FSAA的Ile31、Gln59、Leu163和Ile195四个位点上进行取代，且上述三个优选位点(Ile31、Gln59和Ile195)同时进行取代时具有更优的催化活性。优选地，所述FSAA的突变体分别为：将31位异亮氨酸突变为苏氨酸(Ile31Thr，即I31T)，其是由SEQIDNo.4所示的氨基酸序列组成；将59位谷氨酰胺突变为苏氨酸(Gln59Thr，即Q59T)，其是由SEQIDNo.6所示的氨基酸序列组成；将163位亮氨酸突变为缬氨酸(Leu163Val，即L163V)，其是由SEQIDNo.8所示的氨基酸序列组成；将195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺(Ile195Gln，即I195Q)，其是由SEQIDNo.10所示的氨基酸序列组成；上述四个优选单点突变体的三个双点组合突变，分别为：I31T/Q59T，其是由SEQIDNo.12所示的氨基酸序列组成；Q59T/L163V，其是由SEQIDNo.14所示的氨基酸序列组成；Q59T/I195Q，其是由SEQIDNo.16所示的氨基酸序列组成；上述四个优选单点突变体的二个三点组合突变，分别为I31T/Q59T/L163V,其是由SEQIDNo.18所示的氨基酸序列组成；I31T/Q59T/I195Q，其是由SEQIDNo.20所示的氨基酸序列组成。任何对上述突变体氨基酸序列中氨基酸经过缺失、插入或替换一个或几个氨基酸且具有醛缩酶活性的，仍属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第二方面提供上述FSAA突变体的核苷酸序列。突变体I31T核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.4所示；突变体Q59T核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.5所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.6所示；突变体L163V核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.7所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.8所示；突变体I195Q核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.9所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.10所示；突变体I31T/Q59T核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.11所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.12所示；突变体Q59T/L163V核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.13所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.14所示；突变体Q59T/I195Q核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.15所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.16所示；突变体I31T/Q59T/L163V核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.17所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.18所示；突变体I31T/Q59T/I195Q核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.19所示，其编码氨基酸序列如序列表SEQIDNo.20所示。如本领域技术人员所知，本专利技术的FSAA突变体的核苷酸序列也可以是编码序列表中所示氨基酸组成的蛋白质的其它任何核苷酸序列。任何对所示突变体核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术的第三方面提供一种包含本专利技术的FSAA突变体基因的核苷酸序列的重组表达载体。这些重组载体可通过本领域常规方法将本专利技术的FSAA突变体核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET-30a。本专利技术的第四方面提供一种表达重组FSAA突变体的基因工程菌，可通过将本专利技术的重组表达载体转化至宿主微生物中获得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要满足重组表达载体可以稳定自我复制且所携带的本本文档来自技高网...

【技术保护点】
D‑果糖‑6‑磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于：所述突变体选自a或b：a.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下单个位点突变:31位异亮氨酸、163位亮氨酸及195位异亮氨酸；b.在SEQ ID No.2所示的氨基酸序列基础上含有以下两个或两个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。

【技术特征摘要】
1.D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于：所述突变体选自a或b：a.在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列基础上含有以下单个位点突变:31位异亮氨酸、163位亮氨酸及195位异亮氨酸；b.在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列基础上含有以下两个或两个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。2.根据权利要求1所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，所述突变体在SEQIDNo.2所示的氨基酸序列基础上含有以下三个或三个以上位点突变:31位异亮氨酸、59位谷氨酰胺、163位亮氨酸及195位异亮氨酸。3.根据权利要求1所述的D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体，其特征在于，所述D-果糖-6-磷酸醛缩酶A突变体的氨基酸序列选自下列突变序列：SEQIDNO:4所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸；SEQIDNO:8所示的氨基酸序列，第163位亮氨酸突变为缬氨酸；SEQIDNO:10所示的氨基酸序列，第195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺；SEQIDNO:12所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；SEQIDNO:14所示的氨基酸序列，第163位亮氨酸突变为缬氨酸且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；SEQIDNO:16所示的氨基酸序列，第195位异亮氨酸突变为谷氨酰胺且第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸；SEQIDNO:18所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸，第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸且第163位亮氨酸突变为缬氨酸；SEQIDNO:20所示的氨基酸序列，第31位异亮氨酸突变为苏氨酸，第59位谷氨酰胺突变为苏氨酸且第...

【专利技术属性】
技术研发人员：于洪巍，杨小红，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33