天南星凝集素蛋白编码序列及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种在天南星中表达的新的ａｈ－Ｌｅｃｔｉｎ蛋白、编码序列及其在改良植物对病虫害抗性上的应用。本发明专利技术涉及包含所说基因的融合基因构建体，携带该构建体的新的重组表达载体。还涉及被所说的表达载体转化植物细胞，以及由转化细胞产生的所说基因的转基因植物及其后代，包括植物种子及植物组织。本发明专利技术将所说基因在植物中表达，所获得的转基因植物对植物病虫害具有增强的抗性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学、酶学、生理学以及基因工程等领域。具体地，本专利技术涉及一种在天南星中表达的ah-Lectin蛋白(天南星凝集素蛋白，Arisaemaheterophyllum agglutinin，AHA)及其核酸序列。本专利技术还涉及该蛋白和核酸序列的制备方法和用途。本专利技术中，我们在天南星科(Araceae)植物天南星(Arisaema heterophyllum)中克隆到雪花莲g-Lectin凝集素(GNA)基因的同源基因ah-Lectin。在本专利技术被公布之前，尚未有任何公开或报道过本专利申请中提及的天南星ah-Lectin蛋白序列及其核酸序列。本专利技术的第二目的是提供一种新的天南星蛋白ah-Lectin。本专利技术的第三目的是提供一种利用重组技术生产上述新的天南星ah-Lectin蛋白和核酸序列的方法。本专利技术还提供了这种天南星ah-Lectin蛋白多肽和编码序列在利用转基因技术控制植物病虫害上的应用。在本专利技术的一个方面，提供了一种分离出的DNA分子，该分子包括编码具有天南星ah-Lectin蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位DNA分子的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列杂交。较佳地，所述的序列编码具有SEQ ID NO.4所示的氨基酸序列的多肽。更佳地，所述的序列具有SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列。在本专利技术的另一方面，提供了一种分离出的天南星ah-Lectin蛋白质多肽，它包括具有SEQ ID NO.4氨基酸序列的多肽、或其保守性变异多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。较佳地，该多肽是具有SEQ ID NO.4序列的多肽。在本专利技术的另一方面，还提供了一种载体，它包含上述的DNA分子。在本专利技术的另一方面，还提供了一种用上述载体转化的宿主细胞。在实例中该宿主细胞是BL21和烟草。在本专利技术的另一方面，还提供了一种产生具有天南星ah-Lectin蛋白质活性的多肽的方法，其步骤如下(1)将编码具有天南星ah-Lectin蛋白活性多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，形成天南星ah-Lectin蛋白表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入原核宿主细胞，形成天南星ah-Lectin蛋白的重组细胞；(3)在适合表达天南星ah-Lectin蛋白多肽的条件下，培养步骤(2)中的重组细胞；(4)分离出具有天南星ah-Lectin蛋白活性的基本纯的多肽。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第85-861位的序列。在本专利技术的另一方面，还提供了一种利用转基因技术将编码具有天南星ah-Lectin蛋白活性多肽的核苷酸序列转化入植物以提高植物对病虫害抗性的方法，其步骤如下(1)将编码具有天南星ah-Lectin蛋白活性的多肽的纯化的核苷酸序列可操作地连于植物表达调控序列，形成含天南星ah-Lectin蛋白基因的植物表达载体，所述的核苷酸序列与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列有至少70％的同源性；(2)将步骤(1)中的表达载体转入农杆菌，将含表达载体的农杆菌同真核宿主细胞共培养，在22-28℃条件下，暗培养1-2天后，通过筛选如抗生素筛选，获得含有天南星ah-Lectin蛋白基因的转化细胞并最终再生转基因植株及其后代，包括植物种子及植物组织。含有天南星ah-Lectin蛋白基因的转基因植株对植物病虫害具有增强的抗性作用。较佳地，在该方法中使用的核酸序列具有SEQ ID NO.3中第85-861位的序列。本专利技术还提供了与ah-Lectin蛋白多肽特异性结合的抗体，它包括多克隆抗体和单克隆抗体。在本专利技术中，“分离的”、“纯化的”或“基本纯的”DNA是指，该DNA或片段已从天然状态下位于其两侧的序列中分离出来，还指该DNA或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开，而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中，术语“天南星ah-Lectin蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有天南星ah-Lectin蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第85-861位核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的编码框第85-861位核苷酸中，有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO.3中第85-861位核苷酸序列同源性低至约70％的简并序列也能编码出SEQ ID NO.4所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下，更佳的在高度严紧条件下与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与SEQ ID NO.3中从核苷酸第85-861位的核苷酸序列的同源性至少70％，较佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与天然的天南星ah-Lectin相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-90个，较佳地1-60个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，较佳地为30个以内，更佳地为10个以内，最佳地为5个以内)核苷酸。在本专利技术中，“基本纯的”蛋白质或多肽是指其至少占样品总物质的至少20％，较佳地至少50％，更佳地至少80％，最佳地至少90％(按干重或湿重计)。纯度可以用任何合适的方法进行测量，如用柱层析、PAGE或HPLC法测量多肽的纯度。基本纯的多肽基本上不含天然状态下的伴随其的组分。在本专利技术中，术语“天南星ah-Lectin蛋白或多肽”指具有天南星ah-Lectin蛋白活性的SEQ ID NO.4序列的多肽。该术语还包括具有与天然天南星ah-Lectin相同功能的、SEQ ID NO.4序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括天南星ah-Lectin蛋白的活性片段和活性衍生物。本专利技术的天南星ah-Lectin多肽的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与天南星ah-LectinDNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗天南星ah-Lectin多肽的抗血清获得的多肽或蛋白。本专利技术还提供了其他多肽，如包含天南星ah-Lectin多肽或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本专利技术还包括天南星ah-Lectin多肽的可本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离出的ＤＮＡ分子，其特征在于，它包括：编码具有天南星ａｈ－Ｌｅｃｔｉｎ蛋白质活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列与ＳＥＱＩＤＮＯ．３中从核苷酸第８５－８６１位的核苷酸序列有至少７０％的同源性；或者所述的核苷酸序列能在中度严紧条件下与ＳＥＱＩＤＮＯ．３中从核苷酸第８５－８６１位的核苷酸序列杂交。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：唐克轩，赵秀云，孙小芬，廖志华，游学军，
申请(专利权)人：上海复旦迪恩生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]