通过发酵改进的香兰素的生产制造技术

本发明专利技术涉及通过生物转化从底物生产香兰素的新方法并且该方法允许随着香兰素的形成从发酵液中连续生产和移出香兰素。特别地，本发明专利技术的方法有利地允许减少香兰素在发酵罐中的停留时间并且保持香兰素在发酵液中的浓度低于它的微生物毒性水平。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】通过发酵改进的香兰素的生产
本专利技术涉及通过生物发酵从底物生产香兰素的方法。
技术介绍
香兰素化学名称是4-羟基-3-甲氧基苯甲醛，是食品、饮料、香料、药物以及聚合物中最重要的芳香味道的化合物之一。以往香兰素是从扁叶香果兰(Vanillaplanifolia)、塔希提香荚兰(Vanillatahitiensis)以及歌德罗普香夹兰(Vanillapompona)豆荚中提取的。现今需求变得越来越高，小于5％的世界范围的香兰素生产来自天然香草豆荚。当前，化学合成是生产香兰素的最重要方法。然而，化学合成尽管适合制造香水和化妆品，但却引起了农业食品工业内法律问题。另外，与天然来源的香料比，合成香料又不容易被消费者喜欢。因此，正在进行努力通过用微生物的生物技术方法来获得香兰素。这些方法是基于在传统微生物(如芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)、假单胞菌属(Pseudomonas)以及沙雷氏菌属(Serratia))催化下转化如下底物：木质素、酚芪、异丁香酚、丁香酚、阿魏酸、糖、香草酸、酚芪、废渣以及芳香族氨基酸。最近的来自Kaur和Chakraborty(KaurB，ChakrabortyD.的综述“生产香兰素的生物技术和分子方法：综述。”ApplBiochemBiotechnol.[应用生物化学技术]2013年2月；169(4)：1353-72)列出了若干种用于香兰素生物转化的生物合成途径和合适的细胞。专利申请EP1734128也披露了通过发酵和生物转化生产香兰素的方法。然而，大多数生物转化和发酵的生产率经常被产物对微生物的毒性所限制。特别地，大多数已知的使用生物技术途径生产香兰素的方法具有香兰素对微生物的毒性和降解的问题。另外，香兰素产量受香兰素的进一步转化成降解产物(诸如香草醇和香草酸)影响。在行业中当前的挑战因此是克服这些抑制以提高产量和选择性。以此为目的，已经提出了将提取方法与生物转化步骤联合。这样，生物香兰素的传统联合方法方案总体而言包含如下部分：-生物转化部分，总体上是发酵罐，在其中微生物从底物合成香兰素和最常见的副产品。-生物质过滤部分，其中从含有合成产物和剩余底物的滤液中物理地分离细胞并且然后将其在该发酵罐中再循环以及-选择性分离部分，其中将目标产物(如香兰素)从在该发酵罐中再循环的其他物质中提取出来。作为已考虑过的与经典发酵方法的一些分离技术的代表，尤其可以是提到的液液萃取、基于膜的溶剂萃取(MBSE)和树脂(或溶剂浸渍的树脂)吸附。然而，生物转化步骤与随后的提取方法联合没有完全解决香兰素对微生物的毒性问题，因为香兰素仍然以高的量在该发酵罐中存在。因此，本专利技术目的在于提出一种允许降低香兰素在发酵液中浓度的方法以限制其对微生物的抑制，并且然后推动底物的生物转化，进一步提高香兰素生产的生产率和选择性。
技术实现思路
更精确地说，本专利技术是针对一种通过从底物并且尤其阿魏酸的生物转化来生产香兰素的方法，该方法包括至少由以下项组成的步骤-在发酵罐中培养至少一种能够通过生物转化从底物形成香兰素的微生物，-向所述发酵罐中进料至少一种有待被所述微生物转化的底物，并且-从所述发酵罐的发酵液中回收所生产的香兰素，其中-所述底物至少部分地连续添加到该发酵罐的该发酵液中，并且-在所述底物的连续添加过程中，通过分离装置从该发酵罐中连续提取发酵液流，由此提供(i)不含所述微生物的发酵液组合物(a)以及(ii)包含所述微生物的发酵液组合物(b)其中从全部或一部分的组合物(a)中回收所述香兰素并且将组合物(b)在该发酵罐中全部或至少部分地再循环。因此，诸位专利技术人发现了一种新颖的便于随着香兰素形成从发酵液中连续生产香兰素并且移出香兰素的方法。特别地，本专利技术的方法有利地允许减少香兰素在发酵罐中的停留时间并且保持香兰素在发酵液中的浓度低于它的微生物毒性水平。而且，该发酵罐用新鲜底物的连续进料允许通过使更多底物被转化而促进生物转化。根据本专利技术的方法通过底物的连续添加，发酵液的连续提取和包含所述微生物的全部或部分发酵液组合物(b)的再循环，意味着该发酵液内容物的连续改变。所述的改变对于微生物的代谢可能具有不可预测的结果。产香兰素微生物的代谢方式是复杂的。因此，还不能推定通过根据本专利技术方法观察到的香兰素生物转化的改进。根据优选的实施例，将第一装载量(load)底物加入该发酵罐，并且随后或同时地将一些底物连续进料入该发酵罐中的发酵液中。根据另一个优选的实施例，将组合物(b)全部送回到该发酵罐中。根据另一个优选的实施例，通过膜过滤装置作为分离装置提取该发酵液，由此提供(i)不含所述微生物的滤液以及(ii)包含所述微生物的截留物(b)。根据具体实施例，该分离装置仅旨在形成不含所述微生物的发酵液组合物(a)。所形成的组合物(a)是基于香兰素、非转化底物以及杂质(诸如香草酸、香草醇和愈创木粉)。在此变体中，本专利技术的方法涉及允许从组合物(a)选择性回收香兰素的补充分离技术。特别地，该分离装置(有利地是过滤装置)可以与允许从组合物(a)选择性回收香兰素的补充的分离装置联合。例如，可以将该成分(a)收集在槽中，在该槽中可以用液-液萃取技术提取香兰素。图1说明了该实施例。也可以将包含在组合物(a)中的香兰素选择性地吸附在吸附剂(例如树脂)上。随后，总体而言通过使用香兰素的提取溶剂处理该吸附材料以回收和纯化香兰素。图2说明了此实施例。在两种情况下，包含未转化底物的组合物可以被全部或部分地在该发酵罐中有利地再循环。根据另一个特别的实施例，该分离装置允许同时选择性提取香兰素。图3说明了该实施例。在本专利技术的方法中，总体而言使用仅仅一个发酵罐。然而，如本领域普通技术人员所理解的，该方法也可以使用若干个发酵罐很容易地操作，这些发酵罐经常置于平行设置。当使用若干个发酵罐时，它们可以是彼此基本上相同的或相同的。而且，该发酵罐可以以基本上相同或精确地相同方式工作。附图说明图1说明了本专利技术的与分离装置(液-液萃取装置)联合的方法的实例。图2说明了本专利技术的与分离装置(吸附柱)联合的方法的另一个实例。图3说明了本专利技术的使用分离装置(基于香兰素的选择性膜的过滤装置)的方法的另一个实例。具体实施方式发酵液如上所述，本专利技术方法涉及在发酵罐中培养至少一种可以将转化底物成香兰素的微生物的初步步骤。根据本专利技术，术语“培养”用于表示微生物在合适的培养基中生长。术语“合适的培养基”是指包含细胞的维持和/或生长所需的或对其有益的营养素的培养基(诸如无菌的液体培养基)，营养素是例如碳源或碳底物、氮源、尿素、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵以及磷酸铵；磷源；金属盐，例如镁盐、钴盐和/或锰盐；以及生长因子，例如氨基酸和维生素。典型培养基由10g/l的酵母提取物、20g/l的肽以及20g/l的碳源组成。根据本专利技术，术语“碳源”是指可以被本领域技术人员使用来支持酵母正常生长的碳的任何来源。酵母利用糖作为它们主要的碳源和能源，但是非传统碳源也可以被接受。碳源可以选自下组，该组由以下各项组成：葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、乳糖、乙醇、纤维二糖、甘油以及多糖(例如纤维素)以及它们的混合物。特别地优选的碳源是乙醇和/或葡萄糖。合适氮源的实例是无机氮源例如硝酸盐和铵盐以本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过生物转化从底物生产香兰素的方法，该方法包括至少由以下项组成的步骤‑在发酵罐中培养至少一种能够通过生物转化从底物形成香兰素的微生物，‑向所述发酵罐中进料至少一种有待被所述微生物转化的底物，并且‑从所述发酵罐的发酵液中回收所生产的香兰素，其中‑所述底物至少部分地连续添加到该发酵罐的该发酵液中，并且‑在所述底物的连续添加过程中，通过分离装置从该发酵罐中连续提取发酵液流，由此提供(i)不含所述微生物的发酵液组合物(a)以及(ii)包含所述微生物的发酵液组合物(b)，其中从全部或一部分的组合物(a)中回收所述香兰素并且将组合物(b)在该发酵罐中全部或至少部分地再循环。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.08.07 EP 15306279.91.一种通过生物转化从底物生产香兰素的方法，该方法包括至少由以下项组成的步骤-在发酵罐中培养至少一种能够通过生物转化从底物形成香兰素的微生物，-向所述发酵罐中进料至少一种有待被所述微生物转化的底物，并且-从所述发酵罐的发酵液中回收所生产的香兰素，其中-所述底物至少部分地连续添加到该发酵罐的该发酵液中，并且-在所述底物的连续添加过程中，通过分离装置从该发酵罐中连续提取发酵液流，由此提供(i)不含所述微生物的发酵液组合物(a)以及(ii)包含所述微生物的发酵液组合物(b)，其中从全部或一部分的组合物(a)中回收所述香兰素并且将组合物(b)在该发酵罐中全部或至少部分地再循环。2.根据权利要求1所述的方法，其中将第一装载量底物加入该发酵罐中，并且随后或同时地将一些底物连续加入该发酵罐中的发酵液中。3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该发酵罐内的停留时间范围从1小时至24小时，并且优选地从3小时至10小时。4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中调节底物进料的流量Q进料和组合物(a)流的流量Q(a)以保持在所述发酵罐内恒定体积的发酵液。5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述底物是阿魏酸。6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中该底物以具有在从7至9的范围内的pH溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：M肖夫，S富歇，S加利奈特，G皮雷奥，
申请(专利权)人：罗地亚经营管理公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR