去免疫化的志贺毒素A亚基支架和包含它们的细胞靶向分子制造技术

本发明专利技术涉及包含氨基酸置换的志贺毒素A亚基来源的多肽和细胞靶向分子，所述氨基酸置换给所述多肽提供：1)去免疫化；2)减少的蛋白酶切割敏感性；和/或3)异源表位载荷，同时保留志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性。本发明专利技术的某些多肽在哺乳动物中表现出减小的免疫原性潜力和/或能够将表位递送至所述多肽存在于其中的细胞的MHC类分子。某些包含本发明专利技术的多肽的分子被哺乳动物良好耐受，同时保留上述的一种或多种特征。本发明专利技术的志贺毒素多肽可以用作细胞靶向分子的组分，所述细胞靶向分子用于选择性地杀死特定细胞、用于将载荷选择性地递送至特定细胞和用作用于治疗和诊断多种病患(包括癌症、免疫病症和微生物感染)的治疗和/或诊断分子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】去免疫化的志贺毒素A亚基支架和包含它们的细胞靶向分子
本专利技术涉及从天然存在的志贺毒素的A亚基来源的志贺毒素效应物多肽，其包含突变的组合，所述突变提供(1)去免疫化，(2)蛋白酶敏感性的下降，和/或(3)嵌入的T-细胞表位；其中所述志贺毒素效应物多肽保留一种或多种志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性。在某些实施方案中，本专利技术的志贺毒素效应物多肽(1)在哺乳动物中表现出减小的免疫原性潜力和/或(2)各自能够将CD8+T-细胞表位递送至所述多肽存在于其中的细胞的MHCI类系统。本专利技术也涉及包含本专利技术的志贺毒素效应物多肽的细胞靶向分子。本专利技术的志贺毒素效应物多肽具有作为细胞靶向分子(例如，免疫毒素和配体-毒素融合体)的支架或组分的用途，所述细胞靶向分子用于杀死细胞和/或载荷向某些亚细胞区室的亚细胞递送，例如，嵌入的T-细胞表位向胞质溶胶的递送。一般而言，本专利技术的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子可用于施用给多细胞生物，例如，当需要(1)消除或减小非特异性毒性、(2)消除或减小某些免疫应答和/或(3)靶向对递送给特定细胞类型的特定表位的有益免疫应答(例如，CD8+T-细胞的募集)时。本专利技术的细胞靶向分子可用于(1)选择性地杀死在其它细胞中的特定细胞类型和(2)作为治疗分子用于治疗多种疾病、病症和病患，包括癌症、肿瘤、其它生长异常、免疫病症和微生物感染。背景“魔法子弹”概念是，可以发现仅特异性地攻击人患者内的患病细胞或病原体、同时使患者不受伤害的治疗剂。免疫毒素、配体-毒素杂合体、免疫-RNA酶和其它分子靶向药物是20世纪早期PaulEhrlich博士的“魔法子弹”概念的后代(StrebhardtK，UllrichA，NatRevCancer8：473-80(2008))。由痢疾志贺菌(S.dysenteriae)产生的毒素在Ehrlich博士的同事KiyoshiShiga以后被命名“志贺毒素”，因为他在1897年发现了该细菌。近年来，志贺毒素由于具有独特特征而变得受到赏识，所述独特特征有利于用在用于靶向疗法的细胞内化分子中(参见例如US20150259428)。志贺毒素可以与免疫球蛋白结构域、配体和其它靶向部分组合以建立靶向细胞的治疗剂(例如，免疫毒素和配体-毒素融合体)，其为“魔法子弹”。志贺毒素可能具有用在治疗剂中的有利性能，例如，对真核细胞有效的高效毒素机制，驱动细胞内化的能力，和指导亚细胞按路线发送的能力。通过对毒素的结构、特征和生物活性的合理改变，已经为医学应用合成地工程改造志贺毒素(参见，例如WO1999/040185、WO2005/092917、EP1051482、DE69835695、WO2007/033497、US2009/0156417、JP4339511、US7713915、EP1727827、DE602004027168、EP1945660、JP4934761、EP2228383、US2013/0196928、WO2014/164680、WO2014/164693、US20150259428、WO2015/138435、WO2015/138452、WO2015/113005、WO2015/113007和WO2015/191764，它们中的每一篇通过引用整体并入本文)。志贺毒素A亚基是稳定的、酶活性的和细胞毒性的，即使截短或与其它蛋白结构域融合。涉及合成地工程改造从细菌毒素来源的分子的治疗用途的主要限制包括在接受者中的有害免疫原性应答和由有毒组分造成的非特异性毒性。治疗产物的不希望的免疫原性可以导致不利的后果，诸如降低的效力，中和抗体的产生，改变的药代动力学，一般免疫和超敏反应，过敏反应，过敏样反应，和关于接受者可以安全地接受的重复剂量的数目的约束。降低治疗分子的非特异性毒性可以改善它在施用给接受者时的安全性特征，以及通过增加可以安全地施用的最大剂量而改变它的潜在治疗窗。因为不希望的免疫应答和非特异性毒性可以造成药物疗法的显著安全性和/或效力问题，减小二者的可能性或使其最小化在开发治疗分子时经常是合乎需要的。治疗或诊断分子随时间和在特定环境(例如人循环系统)中的稳定性是重要的特征，且可以影响可实际采用分子的用途。对于某些免疫毒素或配体-毒素融合体，毒素和其它组分之间的连接的稳定性可以影响由未靶向的毒素随时间在多细胞生物体内的释放造成的非特异性毒性的量。因而，对于包含毒素组分的分子，某些非特异性毒性与毒素组分和另一种组分(例如，细胞靶向组分)之间的连接的稳定性直接相关。可以将志贺毒素与异源表位组合以建立靶向细胞的治疗剂，其为了诱导合乎需要的免疫应答的目的递送选择的表位载荷(参见WO2015/113007)。这些免疫应答可以被治疗分子利用用于患者内的特定细胞类型的靶向杀死，以及敏化患者的免疫系统以将某些细胞鉴别为外来物(即破坏免疫耐受性)。例如，这样的方案可以利用主要组织相容性(MHC)I类呈递途径来诱导免疫细胞向患者内的肿瘤部位的募集和增强通过免疫监视机制对某些赘生性细胞的识别。需要获得具有低抗原性、低免疫原性和/或包含异源表位的志贺毒素A亚基来源的多肽，但是其保留显著水平的志贺毒素功能，例如，高效的细胞毒性，驱动细胞内化的能力，和/或有效地按路线发送至期望的细胞内位置的能力。此外，需要获得包含志贺毒素A亚基来源的组分的治疗和/或诊断分子，其具有低抗原性、低免疫原性、高稳定性、低非特异性毒性和/或递送肽-表位载荷用于由靶细胞的MHCI类系统呈递的能力。具体地，需要获得包含志贺毒素A亚基来源的组分的细胞靶向分子，其维持高效的细胞毒性，同时1)减小不希望的抗原性和/或免疫原性的潜力，2)减小非特异性毒性的潜力，和/或3)具有递送肽-表位载荷用于由靶细胞的MHCI类系统呈递的能力。
技术实现思路
本专利技术的志贺毒素A亚基来源的支架各自包含使它们更有用的特征(例如，去免疫化的亚区域、包含异源表位的亚区域、蛋白酶切割抗性的亚区域和/或羧基端、内质网保留/取回信号基序)的组合，例如，作为细胞靶向分子如免疫毒素和配体-毒素融合体的组分。本专利技术的某些组合志贺毒素效应物多肽是更有用的，因为它们在单一多肽中提供几种志贺毒素效应物功能，例如，促进细胞内化、指导亚细胞按路线发送至胞质溶胶、核糖体灭活、和/或将异源T-细胞表位递送至细胞的MHCI类途径。本专利技术的某些细胞靶向分子是更有用的，因为它们在单一分子中提供几种性能的组合，例如，有效的细胞内化、高效的靶向细胞的细胞毒性、选择性细胞毒性、去免疫化、在高剂量的低非特异性毒性、高稳定性、CD+T-细胞超免疫接种、和/或将异源T-细胞表位递送至靶细胞的MHCI类途径的能力。在下面参考编号为#1-11的实施方案的组描述了本专利技术的志贺毒素效应物多肽和细胞靶向分子的不同实施方案。实施方案组#1-包含嵌入的或插入的异源T-细胞表位的去免疫化的志贺毒素效应物多肽本专利技术提供了一种去免疫化的志贺毒素效应物多肽，其包含至少一个插入的或嵌入的异源表位(a)和至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域(b)，其中所述异源表位没有与至少一个被破坏的内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域重叠；且其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出至少一种志贺毒素效应物功能(参见本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种志贺毒素效应物多肽，其包含i)嵌入的或插入的异源CD8+T‑细胞表位，和ii)没有与所述嵌入的或插入的异源CD8+T‑细胞表位重叠的至少一个内源性B‑细胞和/或CD4+T‑细胞表位区域的破坏；其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出志贺毒素效应物功能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.30 US 62/168,758;2015.05.30 US 62/168,759;1.一种志贺毒素效应物多肽，其包含i)嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位，和ii)没有与所述嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位重叠的至少一个内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域的破坏；其中所述志贺毒素效应物多肽能够表现出志贺毒素效应物功能。2.根据权利要求1所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述破坏包含在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组中的B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域中的相对于野生型志贺毒素A亚基的突变：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；SEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205，和SEQIDNO：3的210-218；SEQIDNO：3的240-260；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的243-257；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的254-268；SEQIDNO：3的262-278；SEQIDNO：3的281-297；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的285-293；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的4-33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的34-78；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的77-103；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的128-168；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的160-183；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的236-258；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的274-293。3.根据权利要求1或权利要求2所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述嵌入的或插入的异源CD8+T-细胞表位破坏选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基区域的组的内源性B-细胞表位和/或CD4+T-细胞表位区域：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1-15；SEQIDNO：3的3-14；SEQIDNO：3的26-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的27-37；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的39-48；SEQIDNO：3的42-48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的53-66；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94-115；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的141-153；SEQIDNO：3的140-156；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的179-190；SEQIDNO：3的179-191；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205，和SEQIDNO：3的210-218；SEQIDNO：3的240-260；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的243-257；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的254-268；SEQIDNO：3的262-278；SEQIDNO：3的281-297；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的285-293；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的4-33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的34-78；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的77-103；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的128-168；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的160-183；SEQIDNO：1或SEQ1DNO：2的236-258；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的274-293。4.根据权利要求1-3中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其包含至少2、3、4、5、6、7、8个或更多个内源性B-细胞和/或CD4+T-细胞表位区域的破坏。5.根据权利要求1-4中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含相对于野生型志贺毒素A亚基的氨基酸残基置换。6.根据权利要求1-5中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含与野生型志贺毒素A亚基相比在所述表位区域中的多个氨基酸残基置换。7.根据权利要求1-6中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中至少一个破坏包含与野生型志贺毒素A亚基相比至少1、2、3、4、5、6、7、8个或更多个氨基酸残基置换，且任选地其中至少一个置换发生在选自由以下组成的组的天然地定位的志贺毒素A亚基氨基酸残基处：SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的1；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的4；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的6；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的8；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的9；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的11；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的12；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的33；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的43；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的44；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的45；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的46；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的47；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的48；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的49；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的50；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的51；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的53；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的54；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的55；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的56；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的57；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的58；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的59；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的60；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的61；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的62；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的84；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的88；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的94；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的96；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的104；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的105；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的107；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的108；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的109；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的110；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的111；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的112；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的141；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的147；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的154；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的179；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的180；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的181；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的183；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的184；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的185；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的186；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的187；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的188；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的189；SEQIDNO：3的197；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的198；SEQIDNO：3的204；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的205；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的247；SEQIDNO：3的247；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的248；SEQIDNO：3的250；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的251；SEQIDNO：1、SEQIDNO：2或SEQIDNO：3的264；SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的265；和SEQIDNO：1或SEQIDNO：2的286。8.根据权利要求5-7中的任一项所述的志贺毒素效应物多肽，其中所述置换中的至少一个选自由以下组成的组：D至A、D至G、D至V、D至L、D至I、D至F、D至S、D至Q、D至M、D至R、E至A、E至G、E至V、E至L、E至I、E至F、E至S、E至Q、E至N、E至D、E至M、E至R、F至A、F至G、F至V、F至L、F至I、G至A、G至P、H至A、H至G、H至V、H至L、H至I、H至F、H至M、I至A、I至V、I至G、I至C、K至A、K至G、K至V、K至L、K至I、K至M、K至H、L至A、L至V、L至G、L至C、N至A、N至G、N至V、N至L、N至I、N至F、P至A、P至G、P至F、R至A、R至G、R至V、R至L、R至I、R至F、R至M、R至Q、R至S、R至K、R至H、S至A、S至G、S至V、S至L、S至I、S至F、S至M、T至A、T至G、T至V、T至L、T至I、T至F、T至M、T至S、V至A、V至G、Y至A、Y至G、Y至V、Y至L、Y至I、Y至F、Y至M、和Y至T。9.根据权利要求8所述的志贺毒素效应物多肽，其中一个或多个置换选自由以下组成的组的在志贺毒素A亚基中的天然位置处的置换的组：K1至A、G、V、L、I、F、M和H；T4至A、G、V、L、I、F、M、和S；D6至A、G、V、L、I、F、S、Q和R；S8至A、G、V、I、L、F、和M；T9至A、G、V、I、L、F、M、和S；S9至A、G、V、L、I、F、和M；K11至A、G、V、L、I、F、M和H；T12至A、G、V、I、L、F、M、S、和K；S12至A、G、V、I、L、F、和M；S33至A、G、V、L、I、F、M、和C；S43至A、G、V、L、I、F、和M；G44至A或L；S45至A、G、V、L、I、F、和M；T45至A、G、V、L、I、F、和M；G46至A和P；D47至A、G、V、L、I、F、S、M、和Q；N48至A、G、V、L、M和F；L49至A、V、C、和G；Y49至A、G、V、L、I、F、M、和T；F50至A、G、V、L、I、和T；A51；D53至A、G、V、L、I、F、S、和Q；V54至A、G、I、和L；R55至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；G56至A和P；I57至A、G、V、和M；L57至A、V、C、G、M、和F；D58至A、G、V、L、I、F、S、和Q；P59至A、G、和F；E60至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、T、和R；E61至A、G、V、L、I、F、S、Q、N、D、M、和R；G62至A；R84至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；V88至A和G；I88至A、V、C、和G；D94至A、G、V、L、I、F、S、和Q；S96至A、G、V、I、L、F、和M；T104至A、G、V、L、I、F、M；和N；A105至L；T107至A、G、V、L、I、F、M、和P；S107至A、G、V、L、I、F、M、和P；L108至A、V、C、和G；S109至A、G、V、I、L、F、和M；T109至A、G、V、I、L、F、M、和S；G110至A；S112至A、G、V、L、I、F、和M；D111至A、G、V、L、I、F、S、Q、和T；S112至A、G、V、L、I、F、和M；D141至A、G、V、L、I、F、S、和Q；G147至A；V154至A和G。R179至A、G、V、L、I、F、M、Q、S、K、和H；T180至A、G、V、L、I、F、M、和S；T181至A、G、V、L、I、F、M、和S；D183至A、G、V、L、I、F、S、和Q；D184至A、G、V、L、I、F、S、和Q；L185至A、G、V和C；S186至A、G、V、I、L、F、和M；G187至A；R188至A、G、V...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃里克·波马，埃林·威勒特，加勒特·李·鲁滨逊，桑吉萨·拉贾戈帕兰，布丽吉特·布里斯克，
申请(专利权)人：分子模板公司，
类型：发明
国别省市：美国,US