本发明专利技术提供了快速、灵敏、一致和经济的分析方法，用于基于核酸示踪剂的扩增以及随后的扩增产物的测量来测定分析物和转录因子的活性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及快速和灵敏地检测分析物和病原生物标记物的方法。
技术介绍
同样种类的毒性试剂在病理上一般来说是通过相关的生物化学途径来发挥效应的，这是一个被广泛接受的毒理学原则。因而，已经进行了大量的努力来开发利用机械论手段的生物分析方法，用于检测毒性试剂以及鉴定对各种疾病状态和紊乱以及暴露到偶然或故意引入环境的毒性试剂进行指示的生物标记物。在世界范围内化学工业经过了一个多世纪的快速增长，已经有各种各样的工业有毒物质被生产出来并释放到环境中。例如，多氯化碳氢化合物和类似的卤化有机化合物是对人类有害的有毒污染物。它们在环境中具有持久性，可以在食物链中积累。这其中包括二噁英(dioxin)、呋喃、多氯化联苯(PCBs)、DTT以及这些化合物的类似物和衍生物。已知这些类型的有毒物质可以在人类和动物中引起多种医学问题，包括癌症、发育重要事件的延迟、免疫抑制以及多种外胚层发育异常。例如，已经报道普通人群通过摄取食物中低水平的二噁英类化合物已经慢性接触到二噁英类化合物。二噁英类化合物和PCBs呈现一种重要的工业和环境危险，因为这些化合物对于分解具有抗性，并且可以在植物和动物、包括人的脂肪和油中积累。最近的研究报道了在食物(Alcock等，Chemosphere，1998 371457-1472)和动物饲料(Bernard等，Nature，1999 401231-232)中存在二噁英和PCBs。与二噁英和PCBs接触已经与动物和人类中广范围的毒理学和生物学效应联系上了。其中包括免疫抑制、诱导不需要的酶活性、肿瘤促进、肝细胞毒性以及生殖和发育毒性。已经发生了几次意外的PCBs和二噁英食物中毒，最近的一次是1999年发生在比利时，那次有1克二噁英和50公斤PCBs被引入了食物链。在应对环境污染时一个重要的需求是对这样的毒性化合物的存在进行检测和定量的有效方法。目前可用的技术一般来说昂贵而耗时。例如，传统的分析方法是高分辨率的气相色谱和质谱(GC/MS)，其费用依赖于多快需要结果和分析的复杂性，对于血清而言为1200到2000美元，而对于土壤样品而言为800到1500美元。每一种单独的二噁英同类物的浓度必须通过GC/MS检测，然后通过一个数学公式根据指定的TEF值将其转换为TEQ(参见Clement，Analytical Chemistry，1991 631130A-1139A)。这样的高费用阻止了对人类、食物和环境样品的日常监测。许多提供快速和经济的分析二噁英、PCBs、DTT和无数其它的这种类型的环境有毒物质的方法的尝试依赖于特异性抗体的选择性结合。一种类型的抗体分析方法基于通过一种或多种抗体选择性结合目的毒物。例如，Albro等的美国专利No.4,238,472显示了一种检测二噁英(包括TCDD)的放射性免疫分析方法，而美国专利Nos.5,429,925和5,674,697显示了一种检测二噁英的酶联免疫吸附分析方法(ELISA)。所有的免疫分析方法都依赖于对靶分子的高抗原特异性，以减小定性和定量误差。这种技术的限制是难以构建抗体，所述抗体能够在数百个物质中识别出几个同类物并且鉴别所识别的同类物的相对毒性。各种不同的化学和结构相关的二噁英类化合物的毒性，相对于化合物与细胞内的芳基碳氢化合物(Ah)受体或AhR的结合能力已经被描述。一个化合物作为Ah受体的配体的能力是二噁英类毒性的一个必要条件，这些化合物的毒性也依赖于化合物促进受体在结合配体后转化为DNA结合形式的能力。Ah受体的转化包含了一系列事件，包括无活性的受体从一种包含了一个或多个分子伴侣HSP90分子的蛋白复合物上解离、形成一种包含了HSP90-解离的Ah受体加上结合的二噁英和核蛋白芳基碳氢化合物受体核转运蛋白(ARNT，也称为缺氧诱导因子1β)的新的复合物、以及Ah受体/ARNT复合物与特异性DNA序列的结合。对于二噁英类型的化合物，这些特异性DNA序列或分子是二噁英效应元件(DREs)，位于某些基因的启动子区上游，研究最多的是P4501AI基因。转化的Ah受体和相关的蛋白与DREs的结合增强了相关基因的转录。快速和灵敏的分析检测方法的另一个应用与针对美国及其盟国使用化学或传染性试剂的恐怖活动的威胁紧密相关。恐怖主义的活动是无法预测的，其对策必定包含了发展新的方法，用于快速检测、精确诊断和暴露人群的快速治疗(Claudio，Environmental Health Perspectives 2001 109A529-A536)。除了提供灵敏和快速的检测方法的难度之外，化学战试剂和生物战生物体以及产生的毒物还有可能被修饰以避开检测的危险。这样的修饰可能使得有毒试剂或感染性试剂避开常规的基于结构的技术、例如抗体或基于DNA的测试的检测。此外，生物战生物体的感染活性可能具有被大大提高的潜力，使得它们在利用现有的检测系统所不能检测到的浓度时就具有毒性。在任何情况下，现有的鉴定毒素或有毒物质的方法都需要烦琐的样品制备和复杂精密的仪器设备，导致对威胁的反应存在潜在的灾难性的延迟、或基于不充分的信息的不适当的处理。此外，上面指出的问题突出了对开发新的整合了检测方式的分析方法的需要，所述检测方式集中了对于这样的有毒试剂进行活化的常见病理途径。尽管化学和生物学结构可以被操作，但一般情况下，这些试剂产生它们的病原性的途径不能被改变。对界定了这些有毒试剂的破坏性功能的生物标记物进行监测正是利用了在细胞水平赋予了它们有害性的生物化学基础。有许多有毒试剂在生物和化学恐怖主义情况下对人类是一个威胁。例如，炭疽杆菌(Bacillus anthracis)是一种高毒性的试剂，可以形成极端坚硬的孢子，能够存活非常长的时间。在吸入了炭疽杆菌孢子后疾病可以快速发展，如果不及时治疗会在几天内导致死亡。因此，早期检测和鉴别诊断是关键的。但是，到目前为止，还没有可靠的筛选测试能够在疾病的早期阶段诊断吸入炭疽病(Lane等，Nature Medicine 2001 71271-1273)。特别是，将表现出流感类的症状和病征的其它疾病与吸入炭疽病相区别是困难的。每年有数以百万计的流感或流感类的病例报道。在单个病人中诊断流感的快速流感测试的临床用处是有限的，因为流感快速测试的灵敏度相当低，因此很大比例的患有流感的人不能被检测出来(Lane和Fauci，JAMA 2001 2862595-2597)。快速和灵敏的分析检测方法还有另一个应用，与一组被称为内分泌破坏剂(disrupter)的化合物相关。这些化合物，由于它们对人类和野生动物的有害作用，已经受到一段时间的关注了。内分泌破坏剂是环境中的化学物质，被认为模拟了自然的激素，从而抑制了激素的作用或改变了免疫、神经和内分泌系统的正常的调节功能。研究者已经对环境化学物质的雌激素效应关注了25年以上。许多最近的科学关注来自于日见频繁的报道，这些报道显示发生在激素敏感性受体位点的疾病和功能障碍在多种紊乱、例如在乳腺、子宫和睾丸中是共同的。现在已经知道极低剂量的雌激素(比美国癌症学会认为安全的水平低达50倍)可以引起显著的激素变化。现在被认为与环境内分泌破坏剂相关的效应包括妇女中的乳腺癌和子宫内膜异位、男子中的睾丸和前列腺癌、儿童的性发育异常、男性生育本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于快速检测样品中的分析物的分析方法，该分析方法包括下列步骤： （ａ）将该样品与下列物质接触； １）一种转录因子分析试剂，该试剂能够特异性结合该分析物，其通过与该分析物接触被转化产生功能上与相容的ＤＮＡ效应元件结合的活化转录因子；和 ２）含有至少一个核酸引物识别序列和至少一个能够结合活化转录因子的ＤＮＡ效应元件的核酸示踪剂； 所述样品在促进蛋白－核酸复合物形成的条件下，同时或顺序地与该转录因子分析试剂和该核酸示踪剂接触； （ｂ）将该复合物与未复合的核酸示踪剂分离；以及 （ｃ）通过核酸扩增检测复合的核酸示踪剂的存在； 其中扩增的核酸示踪剂的存在表明在样品中存在分析物。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：兰迪莱曼艾伦，约翰杰弗里斯威利，
申请(专利权)人：海布瑞泽姆公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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