通过全面检测和定量食物中毒细菌的热稳定直接溶血素相关的基因 ( t d h )相关溶血素基制造技术

本发明专利技术可以简单、快捷、准确地检测、定量确定和鉴别弧菌属病原菌产生的热稳定溶血素蛋白组［指的是ＴＤＨ（热稳定直接溶血素），ＴＲＨ（ＴＤＨ相关溶血素）和其它类似溶血素蛋白，下文称为ＴＤＨ相关毒素］的基因。本发明专利技术为检测和定量确定实际产ＴＤＨ相关毒素细菌提供了一种方法，对食品卫生监控具有重要意义。用包含编码ＴＤＨ和ＴＲＨ的共有氨基酸序列的基因序列的引物对，全面检测ＴＤＨ相关毒素基因，由此可以检测和定量确定产ＴＤＨ相关毒素的细菌。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及简捷、快速、准确地对热稳定溶血素(hemolysin)蛋白组的基因进行检测、定量分析和分类的方法，所述热稳定溶血素蛋白组指的是TDH(热稳定直接溶血素)、TRH(TDH相关溶血素)和其它类似的溶血蛋白，下文称为TDH相关毒素，它们是由弧菌属病原菌，如副溶血弧菌、部分霍乱弧菌、最小弧菌和霍氏弧菌产生的。即，本专利技术涉及了渔业、食品工业、公共卫生、临床实验室检测等领域。
技术介绍
弧菌属病原菌，包括副溶血弧菌、部分霍乱弧菌、最小弧菌、霍氏弧菌，是食品卫生控制中重要的细菌种群。口腔感染后会出现严重的症状，并可导致患者死亡。在日本，副溶血弧菌食物中毒的发生率尤其高，在食物中毒的起因中通常居前列。出于此考虑，有必要检测主要感染源-未烹饪的鱼、海产品中的副溶血弧菌。只有一些携带热稳定溶血素蛋白(热稳定直接溶血素TDH)基因和有类似毒素蛋白(TDH相关溶血素TRH)基因的弧菌属细菌才是食物中毒的病因。在食品卫生站点，食品卫生控制是通过设定食物中的副溶血弧菌总数容许量的上限来实现的。其前提是产毒素细菌在从食物(易腐烂的鱼和海产品)中分离的副溶血弧菌中占有一定比例或更多。具体地说，依照“食品卫生检查指南”对怀疑是副溶血弧菌的细菌进行计数。如果细菌数量等于或少于参照值(100cfu/g或更低)，食品就是安全的(依照日本厚生劳动省，药品和食品安全局，食品安全处，标准分处的第22号公告)。如上所述，病原性副溶血弧菌仅是那些能产生TDH或TRH的副溶血弧菌。此外，TDH也存在于除副溶血弧菌外的其它弧菌属细菌中。因此，从更广的角度来说，食物中毒的预防和合乎需要的控制不应该用副溶血弧菌的数量作为指标，而是以是否有产TDH或TRH的细菌的存在或其数量作为。据报道除了副溶血弧菌外的弧菌属细菌，即非01霍乱弧菌、霍氏弧菌和最小弧菌的一些菌株具有产生TDH的基因tdh(Infect.Immun.，52，319-322，1986，J Bacteriol.，171，6859-6861，FEMSMicrobiol.Lett.，84，249-254，1990)。已发现TDH相关毒素蛋白是从弧菌属的实际病原菌的门(phylum)独立进化而来，弧菌属病原菌通过水平传播(horizontal transmission)独立地获得每种毒素(J.Bacteriol.，173，5036-5046)。因此，似乎有一种可能就是除了已知产毒菌株外的其它菌株获得并保留了TDH相关毒素的基因。依此观点，在食品卫生控制站点检测和定量确定能够产生TDH相关毒素蛋白的实际细菌是理想的(ideal)。但是，并没有一个灵活可信的检测和定量确定TDH相关毒素的方法，因此，在食品卫生控制站点很难切实执行。专利技术公开专利技术所要解决的问题如上所述，在食品卫生控制站点对能够产生TDH相关毒素蛋白的实际细菌进行检测和定量是理想的。为此目的展开的TDH相关毒素蛋白编码基因的全面检测和拷贝数的定量分析也是合适的。检测和定量确定TDH相关毒素蛋白使得检测和定量确定可能有相同毒性和病原性的细菌成为可能。然而，用这种方法检测存在着很大的技术问题。具体地说，没有一种方法能够同时并全面地检测TDH相关毒素蛋白组所有已知的基因类型。相应地，当进行基因扩增(比如使用引物的PCR法)和检测时，必须单独设计引物的类型，并且必须同时使用大量的引物进行检测。因此，这种方法是不实际的。另外，后文会提到，把现存的引物结合使用很可能不能检测到所有的TDH相关毒素基因。TDH是一种被认为引起神奈川(Kanagawa)现象的溶血素，神奈川现象与副溶血弧菌食物中毒的病因有关，会出现人红细胞的溶血。有动物实验表明，纯化的TDH与施用活细胞的一例样本产生相似的特性，因此，TDH被认为是致病因子。另一方面，TRH被发现于来源于不出现神奈川现象的食物中毒患者的菌株。TRH在氨基酸水平与TDH有大约68％的同源性，但与TDH不同，TRH是热不稳定溶血素(Infect.Immun.，56，961-965，1988)。已知编码TRH的trh基因包括两型(trh1和trh2)，它们有大约16％的核苷酸序列互不相同(Appl.Environ.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。此外，比较TDH型毒素组(group)和TRH毒素组的氨基酸序列会发现，这两种毒素组都经过了长期的演化过程并获得了各自的基因多样性(diversity)。因此，可能会存在具有未知的中间类型序列的毒素。事实上已经有报道，来源于霍氏弧菌一些菌株的tdh基因与其它弧菌属细菌(如副溶血弧菌)的tdh基因有系统发生上的不同(Microbiol.Immunol.，40，59-65，1996)。此报道还表明3个检测tdh基因的现有PCR引物对中的2个不能完全检测出被检霍氏弧菌的每个tdh基因类型。此外，据报道，就trh基因而言，trh1和trh2基因存在菌株之间的核苷酸序列的差异(Appl.Evniron.Microbiol.，58，2449-2457，1992)。但是，在设计检测trh基因的现有PCR引物时并没有考虑这trh1和trh2基因核苷酸序列间的不同，所以很难说这种检测trh基因的PCR引物令人满意。实际在本专利技术的方法中，发现了一种与TRH类似并且用标准引物很难扩增的新的毒素基因。这些结果强有力地表明除了现已发现的基因外还可能有TDH相关毒素基因存在。现在，分别用于检测产生TDH的tdh基因和产生TRH的trh基因的PCR引物(仅检测tdh基因的引物，仅检测trh1的引物和同时检测trh1和trh2基因的引物)已经被应用于毒素基因的测试(JapanesePatent Laid-Open No.4-293486，Mol.Cell.Probes，6477-487，1992)，而且，它们作为一种研究副溶血弧菌的试剂已经出现在市场上。但是由于上述原因，没有一种商品试剂可以提供检测和定量确定食物中TDH相关毒素或毒素基因的方法。也就是说，如果在食品卫生控制站点使用这种试剂，就需要同时使用多种检测系统，即便如此，仍然可能出现假阴性结果。解决问题的方式作为解决上述问题的研究结果，我们发现了TDH和TRH蛋白存在高度保守区。具体地说，通过对TDH和TRH已知氨基酸序列的多重比对(multi-alignment)分析，我们发现了TDH和TRH中有高度同源性的区域。由此完成了本专利技术。本专利技术的特征在于，可同时检测溶血素基因tdh和trh，方法是利用核苷酸序列设计混合引物(退变引物(degenerate primers))，所述核苷酸序列相应于与具有不同序列的两种类型的溶血素高度同源的氨基酸序列；用PCR方法扩增编码两种类型的溶血素的tdh和trh基因的片段；从产TDH和产TRH菌株中获取扩增片段，其序列的侧翼是引物。此外，本专利技术的特征还在于可以确定毒素类型，功能上与TDH和TRH类似的未知毒素基因片段也可以被检测出来。附图的简单描述[附图说明图1]图1a-1c基于现有的TDH和TRH氨基酸序列进行多重排列分析的结果删除Entrez蛋白数据库里的13种类型的TDH氨基酸序列(8种类型的副溶血弧菌，1种类型的最小弧菌，1种类型的霍乱弧菌和3种类型的霍氏本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测和定量确定携带ＴＤＨ相关毒素［ＴＤＨ（热稳定直接溶血素），ＴＲＨ（ＴＤＨ相关溶血素）］基因的病原菌的方法，包括使用广泛分布于弧菌属病原菌中的，编码热稳定溶血素蛋白组［ＴＤＨ（热稳定直接溶血素），ＴＲＨ（ＴＤＨ相关溶血素）和类似溶血素蛋白，下文称为ＴＤＨ相关毒素］的氨基酸序列中存在的共有氨基酸序列的基因序列，由此广泛而全面地检测和定量确定ＴＤＨ相关毒素基因。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：小泉雄史，山本敏，伊藤武，中川弘，
申请(专利权)人：株式会社日冷，
类型：发明
国别省市：JP[日本]