检测和分型人乳头瘤病毒的扩增-杂交方法技术

本发明专利技术提供了检测和分型人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）的扩增和杂交方法，以及本方法中使用的引物和杂交探针。本发明专利技术涉及适于设计ＨＰＶ属特异和ＨＰＶ基因型特异寡核苷酸杂交探针的ＨＰＶ基因组的具体部分。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了改进的检测和分型人乳头瘤病毒(HPV)的方法。本专利技术的一个方面定义了这样的HPV基因组区域，其适用于设计HPV属特异和HPV基因型特异的杂交寡核苷酸探针，有利地是这些基因组区域互相靠近并在一个扩增子中。本专利技术的另一方面涉及属特异和基因型特异探针的序列。本专利技术的另一方面涉及适用于扩增HPV基因型并检测HPV基因型扩增产物的优化方法及试剂的优化配制(试剂盒)。
技术介绍
已确定很多的乳头瘤病毒序列，见此处引用作为参考的出版物HPV-6de Villiers等人，J.Virology，40(1981)；HPV-11Dartmann等人，Virology151，124-130(1986)；HPV-16Seedorf等人，Virology145，181-185(1985)；HPV-18Cole和Danos，Journal of Molecular Biology93，599-608(1987)；HPV-31Goldsborough等人，Virology171，306-311(1989)；HPV-33Cole和Streeck，J.Virology，58，991-995(1986)；HPV-54Favre等人，J.Cancer45，40-46(1990)；HPV-56Lrincz，J.，Gen.Virol.70，3099(1989)。在多数出版物中已报道HPV的检测和分型，除了Southern印迹和其它杂交技术外，最广泛使用的是基于PCR的方法，因为此类方法可同时提供高灵敏性和特异性，以及该测试法的灵活性使之可根据分析需要而进行较多控制。人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。该病毒显示强烈的上皮细胞嗜性，并且仅在分化的上皮细胞中增殖。怀疑乳头瘤病毒在多种不同的人类疾病中扮演病因学角色，例如，在不同的皮肤病例如在疣、尖锐湿疣和皮肤肿瘤及其它疾病如宫颈癌、肛门生殖癌、喉癌中。已公知，人乳头瘤病毒与这些肿瘤的发病率显示强烈的相关，这点甚至对这些肿瘤的癌前期损害(CIN，VIN，VAIN，PIN，PAIN)也是如此。HPV在99％宫颈癌病人中可检测到。在宫颈癌的形成中，这种紧密的统计学关系可能是HPV的作用导致的。但以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和高风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。HPV病毒不可培养。在HPV的诊断中，可使用HPV血清学试验，该试验可检测与病毒(过去或现在感染)的接触，但不能确切鉴定基因型，并且不能证明现在的感染，这就是为什么它们的作用主要限于流行病学研究。对乳头瘤病毒而言，不存在准确的血清学分类(血清型)，所以检测该病毒DNA基因组的方法用于确定其型别。根据检测是否通过扩增进行，这些可分为2组。在后来方法的一个实施方案中，使用全长基因组RNA探针检测变性的HPV DNA基因组，并用特异抗体(Hibrid Capture-Digene)检测异源二聚体。根据另一个方法，Southern印迹法用于检测不同的HPV基因型。这些方法的缺点是相对不敏感和部分缺少特异性。在杂交捕获方法中，许多出版物报道不同的交叉反应，从而在临床条件下导致假阳性。作者报道，仅在使用高(1ng/ml)DNA浓度的临床对照，该方法的交叉反应是可接受的，其中交叉反应表明灵敏性和特异性之间存在不希望有的联系。通过扩增方法，该问题未出现，因为与灵敏性(扩增)相关的反应分别从与特异性(检测)相关的反应中实施而来。通常扩增技术在选择的扩增基因组片段、引物数和应用的检测技术方面不同。使用最频繁的引物是GP5+-GP6+、MY9-MY11和不同的型特异PCR反应。使用最频繁的检测技术是序列特异杂交、限制片段长度多态性(RFLP)和线性探针试验(LiPA)。除了这些技术外，也使用(但较不常用)对扩增子进行测序和通过dUTP掺入产生的胸苷模式。扩增技术的分析特征在很宽的范围内变化。该方法的特征在于可扩增的基因型、基因型扩增的分析灵敏性、检测的特异性及可信度。在该领域中，考虑将MY9-MY11简并引物系统作为参照反应。在MY9-MY11系统的情况下，存在LiPA杂交检测系统(Innogenetics)。但在该系统中，控制引物的简并合成是困难的，这是因为合成中产生的引物种类的相对比例在每次的合成中是变化的，这会导致对PCR反应进行分析的不可预测的变化，第二，与其它普及的反应比较，该反应可扩增最少的型别。从文献中已众所周知，如果HPV基因型51型特异引物加入反应中，该系统仅可在这种情况下扩增基因型51。使用简并的引物合成时，引物种类的相对比例不可改变，并且不能改变引物比率以获得基因型较好的分析特性和均衡扩增。仅通过使用仔细选择的、优化的生殖器HPV序列的引物对，GP5+-GP6+反应可解决相同的问题，这两个引物系统易于处理，但灵活性较低。GP5+-GP6+系统可扩增许多已知的HPV基因型，但该系统的分析特征未优化(灵敏性对不同的基因型不平衡)，并且除了对解链温度和Mg2+浓度进行有限的优化外，对两引物法的优化是受限的，例如对个体基因型检测的灵敏性进行平衡是非常困难的。将GP5+-GP6+系统应用于扩增其它基因型是困难的，在任何情况下，这将影响其将来的应用，因为检测新基因型的需要是长期存在的。基因型的鉴定还未充分得到解决。另一个众所周知广泛的基因型特异扩增方法是L1C方法具有2种形式的双引物系统用于扩增更多的基因型，一种形式是使用(带有LC1引物)L1C2或新L1C2引物。L1C扩增子的详细描述见文献。基本上，扩增后的检测法必须满足2条要求常规诊断的适用性(简单、成本、时间)和需要适当水平的分辨能力。相当多的方法由于其辨别能力而不适用，因此使用RFLP是受限的，因为扩增区很短、无足够的诊断用限制性位点、以及基因型常常仅分为小组。同样的，将SSCP的复杂模式适应于具体基因型是困难的，此外，这些反应的稳定性也不令人满意。从诊断上来说为了满足常规需求，分辨能力是尤其重要的。从简单性和分辨能力的方面来说，如果样本不是基因型的混合物，测序是理想的方法，因为自动化得到解决，并且可检测每种基因型(或其亚型)。但实际上，它并未得到广泛使用，因为它很昂贵且费时，在常规诊断实验室它的应用不可接受，并且在为混合样本的情况下，不能确定任何基因型。杂交方法的优点是它们的分辨能力或严格性可轻易得到改变，因为反应的几个参数可在广泛的范围内改变，一些杂交形式易于自动化、不是很昂贵，并且在平行进行(一些杂交形式)的情况下，即使费时也是无关紧要的。因此，需要新的HPV扩增检测方法，这些方法应能消除当前方法的缺点，这些方法应便宜、易于重复和自动化。本专利技术描述了引物是独立合成的分子的扩增和杂交测试法，因此，它们的相对比例可轻易得到控制和优化，并且扩增具有平衡的灵敏性。杂交反应是以高度平行模式实施的，其为低花费、快速、灵活和可自动化的反应。专利技术概述本专利技术提供/定义了位于一致扩增子(consensus ampl本文档来自技高网...

【技术保护点】
人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）Ｌ１基因的一致引物，其中所述引物由下述核苷酸序列之一组成：ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：３７－４０或ＳＥＱ．ＩＤ．ＮＯ：７０－７２。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C耶奈伊，T陶卡奇，
申请(专利权)人：类基因有限责任公司，
类型：发明
国别省市：HU[匈牙利]