测定延伸产物的存在的方法技术

本发明专利技术涉及一种方法及试剂，用于测定在包含核酸链延伸的反应如循环微测序中产生的延伸产物，还涉及该方法在鉴定特异性点突变和遗传变异中的应用。需要三种标准的未修饰的引物，可用一种非特异荧光试剂（如一种单链ＤＮＡ结合染料）作为ＦＲＥＴ检测中使用的荧光团之一。该发明专利技术还涉及垂直光束荧光计量术。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种方法及试剂，用于测定在包含核酸链延伸的反应如循环微测序(cyclic minisequencing)中产生的延伸产物，还涉及该方法在检测特异性点突变和遗传变异中的应用。
技术介绍
点突变，即基因中单个核苷酸的改变，是人类遗传病的一个主要原因。因为诊断的目的，有很多适用于检测已知点突变的技术。这些方法可分为依靠全部和部分互补DNA链之间的差示杂交动力学手段的，或是依靠酶辅助点突变检测的(Landegren，et al.，1998)。利用放射性标记寡核苷酸探针进行的经典ASO(等位基因特异性寡核苷酸杂交)(Wallace，et al.，1979)，经过多年的发展已成为一种动力学均一性分析系统(Whitcombe，et al.，1998；Wittwer，et al.，1997a；Wittwer，et al.，1997b)，这证明了该领域的快速发展。当高密度DNA阵列可以直接在玻璃表面合成后，研究成百上千的突变成为可能(Fodor，et al.，1991；Lipshutz，etal.，1999)。这种快速发展的DNA微阵列技术也是基于全部和部分互补DNA链之间的差示杂交。酶辅助方法一般是依靠DNA聚合酶或DNA连接酶的活性(Barany，1991；Landegren，et al.，1988；Wallace，et al.，1979)。最初用于处理单个样品的点突变分析(Syvanen，et al.，1990)(Ihalainen，et al.，1994)已经发展成为一种以阵列形式完成的多元分析(Kurg，et al.，2000；Pastinen，et al.，1997；Pastinen，etal.，1996；Pastinen，et al.，2000；Shumaker，et al.，1996)，并且可以用于检测点突变或单核苷酸多态性(SNP)。在所有这些系统中，只有在测试探针完全互补于靶序列的检测环境条件下，才能形成可检测到的反应产物(Syvanen，1999)。在依赖DNA聚合酶的检测中，只有当反应混合物中存在可以与模板DNA中的序列互补的核苷三磷酸时，才能形成反应产物。目前有多种已经过深入研究的工具用于检测已知点突变，但单次试验的价格相对较高。在最近的遗传学研究进展中这已成为一个主要担心的问题，因为越来越明显地是，个体之间的差异是由于我们的基因组中每1～2kb内随机分布的微小差异如SNP造成的(Sachidanandam，et al.，2001)。在公共数据库中已有至少1.4×106个SNP(Sachidanandam，et al.，2001)，这一数字还将与日俱增，而且SNP已成为遗传学和生物医学研究的一种有力手段。这些差异在对致病基因或易感基因的鉴定和精细作图中也是很有用的。特别是，多因子疾病目前是用SNP基因分型来研究的。用SNP进行基因分型的一个主要问题是，单个的SNP没有足够的信息，有效鉴定如与某疾病相关的等位基因，需要位于该染色体上一个狭窄节段内的一组SNP(SNP单体型)，其结果是必须研究比传统标记更多的SNP标记(Dawson，1999；Isaksson，et al.，2000；Martin，et al.，2000)，而且必须开发出非常成熟的算法(Morris，etal.，2000)才能得到可靠的结果。寻找这些单核苷差异的最常用方法是对基因的多态性区域直接进行DNA测序，通常是在用聚合酶链式反应(PCR)扩增从靶组织中分离到的基因组DNA或mRNA之后。不过，由于大规模人类测序计划中累积的原始测序数据的巨大容量，通过比较从多个个体中获得的有效序列，经计算机程序鉴定出了大量的SNP。获得足够量SNP数据的主要困难之一是目前用于对他们进行检测的方法的复杂性及高额花费。SNP基因分型方法的主要花费之一是对用于这些检测的寡核苷酸引物进行修饰。对寡核苷酸引物进行标记或其他修饰，通常是与锚定或荧光检测单元偶联，同时还有这些偶联反应后的必需的纯化步骤，增加了单个寡核苷酸的花费。如果一个项目中需要数百个经修饰的寡核苷酸，随着时间的延长这将成为一个主要的花费。最令人激动的可能性是，DNA阵列技术的使用具有比较高的前期花费，但阵列一旦印好，测试格局就不再改变，而且不必重新印制这些模片就可以完成所有的SNP。由于这个原因，本专利技术中开发出了一种便宜、耐用且简单的方法，用于检测在涉及核酸链延伸的反应中的延伸产物，也就是经延伸的寡核苷酸引物。本专利技术还涉及一种用于检测循环微测序(cyclic mini sequencing)结果的有效方法，所述测序用于如SNP的检测中。这里描述的新方法主要优势是，当分析一个SNP时，仅需要三个便宜的标准非修饰引物，两个用于PCR扩增病人基因组DNA中的目标区域，一个用于循环微测序(cMS)以检测由上述PCR扩增所得模板核酸中的特异性位点(SNP)。如果两条链都要检测SNP，只需另外加一种非修饰引物。本专利技术的方法允许以任何次序灵活地研究SNP，而且可以在需要的时候在整体设计中添加或去除SNP。在对一个目标区域进行精细作图时这是很重要的。当检测不同的SNP时，只需要做略作优化或修饰。该检测是基于荧光检测，可以用一个标准板式荧光计来完成，而且该检测可与全自动液体处理步骤相兼容。本专利技术的方法还涉及一种利用荧光共振能转移(FRET)的方法，FRET是指在两种染料分子的电子激发态之间发生的距离依赖性相互作用，其中在没有质子发射的情况下激发能从一个供体分子转移至一个受体分子。FRET的基本条件是(i)供体(源)和受体(靶)分子一定要十分接近(一般要在10～100)；(ii)受体吸收波谱一定要与供体的荧光发射波谱相重叠。在美国专利号6,028,190中，描述了用这类能量转移偶联型染料标记的探针。荧光已被证明是一种有无数应用的万能工具。在分析化学、生物化学、细胞生物学、生理学、肾脏学、心病学、光化学和环境科学等领域的分子相互作用研究中，该方法都是一种有效的技术。对于在纳摩浓度水平进行研究的分析化学家或生命科学家来说，该方法值得夸耀的是其出色的灵敏性。而且荧光法提供的远不止于信号收集能力。在仪器、软件、探针和应用各方面的新发展，已使这一在150年前首次发现的技术迅速流行。由于对荧光理论基础的了解更加深入，出现了一系列更有效的应用，能够提供关于复杂分子及其反应途径的详细信息。可以方便地在原位进行生化物质结合的研究。也有可能对大分子的内部距离进行测量。可以研究蛋白质折叠动力学。可以在活细胞内测量离子浓度。可以用荧光探针对膜结构和功能进行研究。可以研究药物与细胞受体之间的相互作用。可对混合物中痕量荧光物质进行检测和鉴定。可根据油类样品的荧光对他们进行指纹绘图和鉴定。可阐明分子的激发态的电子结构和动力学。这里仅列举了现代荧光技术应用的几个实例。荧光是一种现象，该现象中荧光分子吸收某一给定波长的光后发射更长波长的光。能引发荧光的波长依赖性强度的分布被称作荧光激发波谱，发射能的波长依赖性强度分布被称作荧光发射波谱。荧光检测相对其他基于光的研究方法来说有三个主要优势高灵敏度、高速度和安全性。安全性是指，在加工过程中样品不受影响或毁坏，也没有有害副产物产生。灵敏度是一个重要问题，因为荧光信号本文档来自技高网...

【技术保护点】
在反应混合物中测定延伸产物，即经延伸后的寡核苷酸引物的存在的方法，其中，将要通过模板依赖方式掺入寡核苷酸引物３′端的脱氧核苷（５′－）三磷酸（ｄＮＴＰ）中含有标记，该方法包括如下步骤：ａ）在适于引物延伸的条件下，用该ｄＮＴＰ延伸该寡 核苷酸引物；ｂ）使荧光试剂与得自步骤ａ）的所述经延伸的寡核苷酸引物接触，从而与该延伸的寡核苷酸引物结合；ｃ）通过测量激发后的荧光发射强度来测定该延伸的寡核苷酸引物的存在。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：阿托奥帕纳，奥斯莫斯沃瓦尼米，
申请(专利权)人：拜奥希特公司，
类型：发明
国别省市：FI[芬兰]