淋球菌快速检测试剂制造技术

本发明专利技术提供了一种淋球菌快速检测试剂，是由分别存放的氧化酶反应试剂和脯氨酸氨基肽酶反应试剂组成。氧化酶反应试剂是浓度为１０ｇ／ｌ的盐酸四甲基对苯二胺水溶液，脯氨酸氨基肽酶反应试剂是由分别存放的Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｆ六种试剂组成，试剂Ａ是浓度为２ｇ／ｌＬ－脯氨酸－Ｐ－硝基苯胺水溶解液，试剂Ｂ是浓度为０．０１ｍｏｌ／ｌＰＢＳ，试剂Ｃ是浓度为２．５ｍｏｌ／ｌ盐酸水溶解液，试剂Ｄ是浓度为１１ｇ／ｌ亚硝酸钠水溶解液，试剂Ｅ是浓度为５ｇ／ｌ氨基磺酸铵水溶解液，试剂Ｆ是浓度为０．５５ｇ／ｌＮ－（１－萘基）乙二胺二盐酸无水乙醇溶解液。依据尿道分泌物中只有淋球菌氧化酶试验与脯氨酸氨基肽酶试验同时呈阳性的特点来检测尿道分泌物中的淋球菌。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术用于检测患者尿道分泌物中的淋球菌，属于生化诊断试剂的领域。
技术介绍
淋病是最常见的性传播疾病之一，在世界上广为流行，造成世界范围的危险，对人类的健康带来极大的危害。淋病的病原体是淋病奈瑟氏菌，又称作淋球菌，人类是淋球菌的唯一天然宿主，主要感染粘膜，尤其是对尿道粘膜有很强的亲和力。淋球菌侵入男、女尿道后，借助粘附因子粘附到上皮细胞表面进行繁殖。淋球菌感染后约有1％的男性无任何症状，75％的女性患者无症状，因此，仅凭有无临床症状作为判断是否感染淋球菌的依据，漏诊率极高，尤其是女性，所以建立准确可靠的检测方法十分必要。目前，对淋球菌的检测方法主要集中于以下几种一、直接涂片染色法，取尿道分泌物涂片后做革兰氏染色，在镜下可见中性粒细胞内有革兰阳性双球菌。二、淋球菌的分离培养与鉴定培养，分离与鉴定培养是目前世界卫生组织认定推荐的筛选淋球菌的唯一方法，对症状轻微的男、女性都很敏感。同时淋球菌抵抗力弱，对温湿度要求高，培养时操作技术非常重要，37℃烛缸法培养24小时后观察有圆形凸起、湿润光滑、半透明、灰白色的可疑菌落再进行鉴定试验。三、氧化酶试验，细菌经培养后形态凝似淋球菌，若氧化酶试验呈阳性，可初步鉴定为淋球菌。四、聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction PCR)，又称体外酶促扩增，是近几年发展起来的一项技术，是分子学技术的突破。它是在人工条件下模拟天然DNA复制过程，对特定DNA片段进行快速扩增，扩增后的产物能在分析仪下肉眼可见。该方法灵敏度高，特异性强，但是对所需试剂的质量和技术人员的素质要求高，且有极高的假阳性及假阴性率，限制了其在基层医院的开展。
技术实现思路
1.氧化酶反应试剂的配制称取10mg盐酸四甲基对苯二胺溶解于1ml蒸馏水中即得浓度为10g/l的盐酸四甲基对苯二胺水溶解液。细菌中氧化酶可使细胞色素C氧化，此氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化产生紫红色。2.脯氨酸氨基肽酶反应试剂的配制按下列配比配制试剂A、B、C、D、E、F并分别装入六个不同的瓶子里。a.试剂A用电子天平称取2mg L-脯氨酸-P-硝基苯胺溶解于1ml蒸馏水中即得浓度为2g/l L-脯氨酸-P-硝基苯胺水溶解液，混匀，4℃储存备用。b.试剂B用电子天平称取0.3g NaH2PO4.2H2O和2.905g Na2HPO4.12H2O加蒸馏水50ml充分溶解，再加入8.5g NaCl，充分搅拌定溶至1000ml即得0.01mol/L磷酸盐缓冲液(PBS)，4℃储存备用。c.试剂C室温下用5ml加样器吸取2.75ml 11.6mol/L浓盐酸加入到盛有10ml蒸馏水的试管中，混匀即得2.5mol/L盐酸水溶解液，4℃储存备用。d.试剂D用电子天平称取11mg亚硝酸钠溶解于1ml蒸馏水中，混匀即得11g/l亚硝酸钠水溶解液，4℃储存备用。e.试剂E用电子天平称取5mg氨基磺酸铵固体溶解于1ml蒸馏水中，混匀即得5g/l氨基磺酸铵水溶解液，4℃储存备用。f.试剂F用电子天平称取55mg N-(1-萘基)乙二胺二盐酸固体溶解于100ml无水乙醇中，混匀即得0.55g/l N-(1-萘基)乙二胺二盐酸无水乙醇溶解液，4℃储存备用。细菌中脯氨酸氨基肽酶可分解试剂A的L-脯氨酸-P-硝基苯胺产生对硝基苯胺，对硝基苯胺在试剂C的酸性溶液中与试剂D的亚硝酸钠发生重氮化反应生成重氮化合物，此重氮化合物与试剂E的氨基磺酸铵和试剂F的N-(1-萘基)乙二胺二盐酸偶合反应后呈红色。患者尿道分泌物中的淋球菌能同时分泌氧化酶和脯氨酸氨基肽酶，氧化酶可使细胞色素C氧化，此氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化呈紫红色为阳性，若氧化酶不存在则对苯二胺不被氧化而无颜色变化为阴性；同时脯氨酸氨基肽酶可分解试剂A产生对硝基苯胺，对硝基苯胺在试剂C的酸性溶液中与试剂D的亚硝酸钠发生重氮化反应生成重氮化合物，此重氮化合物与试剂E的氨基磺酸铵和试剂F的N-(1-萘基)乙二胺二盐酸发生偶合反应后呈红色为阳性，若脯氨酸氨基肽酶不存在则试剂A的L-脯氨酸-P-硝基苯胺不能被分解而无对硝基苯胺生成，加入试剂C、试剂D、试剂E、试剂F后无重氮化偶合反应产生而没有颜色变化为阴性。所以当尿道分泌物的氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验都呈阳性时，可确诊分泌物中含有淋球菌。同时在患者的尿道分泌物中可能存在不动杆菌，动弯杆菌，阴道加德纳菌，脑膜炎奈瑟氏菌，铜绿假单胞菌，杜克雷嗜血杆菌，消连链球菌，金黄色葡萄球菌，生殖道支原体，解脲支原体这些细菌中的一种或几种，但氧化酶试验呈阳性的细菌是脑膜炎奈瑟氏菌，铜绿假单胞菌；脯氨酸氨基肽酶试验呈阳性的细菌是动弯杆菌，阴道加德纳菌，杜克雷嗜血杆菌，所以在患者尿道分泌物中除了淋球菌外没有一种细菌的氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验同时呈阳性。这样，通过氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验联合检测患者尿道分泌物中的淋球菌，特异性强，准确度高，可以排除不动杆菌，动弯杆菌，阴道加德纳菌，脑膜炎奈瑟氏菌，铜绿假单胞菌，杜克雷嗜血杆菌，消连链球菌，金黄色葡萄球菌，生殖道支原体，解脲支原体的干扰。与直接涂片染色法、分离与鉴定培养法、PCR法和氧化酶法相比，镜检法中某些条件致病菌(如不动杆菌)形态与淋球菌相似，易误认为是淋球菌；细菌培养法所耗时间长，淋球菌对寒冷抵抗力很弱，对温湿度要求严格，对干燥和防腐剂敏感，室温下离体容易死亡，所以对标本质量和操作技术要求高，培养成功率低；PCR法虽然灵敏度高，特异性强，但它需要高质量的基因扩增仪(确保时间和温度的准确)，优质的试剂和经过专业培训的高素质技术人员，操作步骤繁琐、费时，一般的医院难以开展。使用本试剂的有益效果是可以准确、快速、方便地检测出患者尿道分泌物中的淋球菌，不需要大型仪器设备，适合在各级医疗科研机构中使用。具体实施例方式本专利技术用于检测患者尿道分泌物中存在的淋球菌，由氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验联合检测确定，具体实施步骤如下1.氧化酶试验步骤a用洁净的无菌棉拭子取患者尿道口分泌物。b将沾有分泌物的棉拭子在玻片上轻轻挤干，使分泌物涂布于玻片上。c在分泌物上滴加一滴氧化酶反应试剂，五分钟内分泌物由无色变为紫红色即为阳性，不变色为阴性。2.脯氨酸氨基肽酶试验步骤。a在反应瓶里加入560ul试剂A。b用洁净的无菌棉拭子取患者尿道口分泌物。c.将粘有分泌物的棉拭子放入反应瓶内，加入80ul试剂B将拭子上的分泌物充分洗脱，在瓶壁上挤干，弃去棉拭子。d.盖上瓶盖，轻轻摇匀，在37℃±1℃水浴箱中反应5min。e.取出，依次加入试剂C 80ul、试剂D 80ul，混匀，再依次加入试剂E 80ul和试剂F 80ul，充分混匀。f.室温下静置，五分钟内观察反应瓶内溶液颜色变化，若呈现红色即为阳性，不变色为阴性。若尿道分泌物氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验反应同时呈阳性，则可确诊尿道分泌物中含有淋球菌；若尿道分泌物只有氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验中的一种试验呈阳性或这两种试验都呈阴性则尿道分泌物中不含淋球菌。权利要求1.淋球菌检测试剂，其特征在于它与患者尿道分泌物的氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验都呈阳性时，可确诊该患者尿道分泌物中含有淋球菌。该试剂是由分别存放的氧化酶反应试剂和脯氨酸氨基肽酶反应试剂组成。2.根据权利要求1中所本文档来自技高网...

【技术保护点】
淋球菌检测试剂，其特征在于它与患者尿道分泌物的氧化酶试验和脯氨酸氨基肽酶试验都呈阳性时，可确诊该患者尿道分泌物中含有淋球菌。该试剂是由分别存放的氧化酶反应试剂和脯氨酸氨基肽酶反应试剂组成。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王虹，
申请(专利权)人：广州蓝星生物科技开发有限公司，
类型：发明
国别省市：81[中国|广州]