一种耐大观霉素淋球菌的检测试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种利用遗传标记物来同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法及试剂盒，特别是选取淋球菌１６ＳｒＲＮＡ的核苷酸序列，设计出了特异性检测的寡核苷酸引物和探针。本发明专利技术可方便、快速、准确地定性检测和定量计数淋球菌，同时鉴别是否发生了淋球菌大观霉素的突变。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及实时荧光PCR检测。
技术介绍
淋病的病原体是淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae，简称为淋球菌或NG)，它对人的感染力强，既无有效疫苗，治愈后又无持久的免疫力，该病除了可引起泌尿生殖系统化脓性感染外，还会引起淋菌性眼炎、咽喉炎、直肠炎、盆腔炎等合并性或播散性感染。根据世界卫生组织估计，全球每年淋病发病数约为2500万；我国淋病的发病率较长期居性病发病率的前两位，2003年淋病报病数为59776例，居需传报传染病发病率第四位。正确和规范使用抗生素，能快速治愈淋病，避免淋病慢性化及迁延化，是淋病防治的主要手段。但是，由于抗生素的大量不规范运用，以及NG基因突变(如质粒介导耐药、染色体突变耐药)，致使临床经常发现淋病对多种抗生素产生耐药，导致了淋病在人群中的长期存在和流行。美国CDC认为当一种抗生素对细菌的耐药率大于5％，该药就不应作为治疗该病的第一线用药，以按此为标准，现我国仅剩两个临床一线用药(大观霉素和头孢三嗪)，上述药物在我国的耐药率分别为0.36％，0.46％，耐大观霉素淋球菌在世界范围内目前仍然少见。我国已加入了全球淋病耐药监测网，以密切监测淋病对常见药物耐药性的动态变化，指导临床用药，具有重要意义。常用药敏试验有纸片扩散法、琼脂稀释法、测β—内酰胺酶、耐药基因检测探针等，其中琼脂稀释法是WHO的标准方法，该方法测定各种抗生素对淋球菌的最小抑菌浓度(MIC)，前两种方法先通过培养患者的样本鉴定为淋球菌后，再用纯菌来培养检测，该方法培养周期长，试验过程繁琐；纸片扩散法受人为因素影响大，重现性和定量性不足；测β—内酰胺酶能检测耐药性的一个指标；耐药基因检测探针特异性强、灵敏度高、准确度好，是一个好的检测耐药性的方法。尤其是近年来发展起来的荧光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，FQ-PCR)技术可弥补上述不足。荧光定量PCR灵敏度高，特异性好，速度快，已在基因表达水平分析、病原体的定性检测和定量检测等方面得到广泛应用，是当前病原体核酸检测和序列分析的主要方法。国内目前也已有合格的乙肝、艾滋病、结核检测的PCR试剂盒。对于聚合酶链式反应来说，选择待扩增的靶DNA的碱基序列是最为重要的。16S rRNA是原核生物中高度保守基因序列，大小为1500碱基对左右，具有(1)保守性高，在生物进化中比其他基因演变得慢，有“分子化石”之称；(2)保守性是相对的，不同科、属、种间都有不同程度的差异；(3)不能侧向转移；(4)大小适度，能满足进行比较、扩增的要求。所以，通过聚合酶链式反应扩增检测淋球菌，16SrRNA基因具有一定优势。在此基础上设计的引物，可以对淋球菌高效扩增。据最近的报道，导致淋球菌产生大观霉素耐药性的突变也发生在16SrRNA基因，突变区域与扩增区域的一致使得定量检测和突变鉴定同时进行成为可能，但是目前尚未有报道确定可用于检测耐大观霉素淋球菌的特异性遗传标记物序列，也没有见到相应的方法或试剂盒能够同时完成对淋球菌的检测和耐大观霉素突变区的鉴定。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种既能够有效检测淋球菌又可有效鉴定耐大观霉素突变株的聚合酶链式反应方法及试剂盒。技术方案本专利技术从淋球菌基因组中有目的的选出了一段约1500个碱基对的16S核糖体RNA基因(16S ribosomal RNA gene)(ANTIMICROBIAL AGENTS ANDCHEMOTHERAPY，May.2000，p.1365-1366)，适合作为特异性PCR检测的扩增靶序列。如本文所用，术语“16S ribosomal RNA gene”或“16S核糖体RNA基因”指编码淋球菌16S核糖体RNA的核苷酸序列，其GenBank登录号X07714，具体序列示于SEQ ID NO1。本专利技术还提供一种同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，反应的步骤依次为 (1)抽提样品的DNA；(2)将抽提的DNA作为模板，用一对正反引物进行PCR扩增；(3)检测扩增产物以确定样品中是否存在淋球菌株；(4)鉴定扩增产物是否存在突变以检测大观霉素耐药性；其中，正引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，反引物与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补，长度范围均为15-35个核苷酸。本专利技术进一步提供同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的优选方案，即正反引物设计于SEQ ID NO2的两端。本专利技术提供上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的一种优选方案为，所说引物中的一个为5’CATTAGTTGC CATCATTCG3’，另一个为5’CCCTCTGTAC CGACCATT 3’。本专利技术还提供上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法另一种优选方案，即所述反应还含有两个长度为15-30个核苷酸的探针，其中一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列相同，另一个探针的序列与SEQ ID NO1中所示的部分序列互补。上述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的两个DNA探针序列分别为5’ACGTCAAGTC CTCATGGC3’和5’CGTGTGAAGC CCTGGTCAT 3’。本专利技术还提供所述的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的优选方案，其反应的扩增产物的长度为70-160个核苷酸对。本专利技术的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的步骤(3)是通过检测荧光信号的强弱来定量检测样品中的淋球菌。本专利技术的同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法的进一步优选方案为，所述的步骤(4)是通过检测另一种荧光信号并与步骤(3)的荧光信号进行比对来定性检测样品中淋球菌的突变情况。基于SEQ ID NO1和2，本专利技术不仅提供了一种利用聚合酶链式反应扩增16S核糖体RNA基因检测耐大观霉素淋球菌的方法，还提供一种快速定量检测耐大观霉素淋球菌的荧光定量PCR试剂盒。本专利技术提供的含有上述的检测淋球菌的遗传标记物的试剂盒，试剂组成包括DNA裂解液、荧光定量反应液、定量校准品、阳性对照品、阴性对照品、突变对照品，其中，定量校准品是含有所述的SEQ ID NO2的136个核苷酸序列的质粒。本专利技术的关键是使用了特异性扩增耐大观霉素淋球菌遗传标记物的引物对，所述的引物长度为15-35个核苷酸，且一个引物的序列SEQ ID NO3与SEQID NO1所示的部分序列相同，且另一个引物的序列SEQ ID NO4与SEQ ID NO1所示的部分序列互补，且扩增产物的长度为136bp。SEQ ID NO3和4分别对应于SEQ ID NO1的1120和1238bp位置。本专利技术所述的特异性扩增耐大观霉素淋球菌的引物以及检测用探针，可根据遗传标记物的序列SEQ ID NO1或2进行设计，并通过常规的DNA合成方法获得，例如可以用商业化的DNA自动合成仪合成。本专利技术的这些引物可以用放射性同位素、生物素、酶、荧光素或其他化学发光物质进行标记。为了减少假阳性，并完成耐大观霉本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种同时检测淋球菌及其耐大观霉素突变位点的聚合酶链式反应方法，其特征在于所述反应的步骤依次为：（１）抽提样品的ＤＮＡ；（２）将抽提的ＤＮＡ作为模板，用一对正反引物进行ＰＣＲ扩增；（３）检测扩增产物以确定样品中是否存在 淋球菌株；（４）鉴定扩增产物是否存在突变以检测大观霉素耐药性；其中，正引物与ＳＥＱＩＤＮＯ：１中所示的部分序列相同，反引物与ＳＥＱＩＤＮＯ：１中所示的部分序列互补，长度范围均为１５－３５个核苷酸。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张继伦，李超，周煜，夏懿，
申请(专利权)人：上海复星医学科技发展有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]