提供了检测短串联重复多态性（ＳＴＲＰ）如脆性Ｘ染色体综合征的方法，其中采用ＰＣＲ扩增基因组ＤＮＡ染色体中的核酸，扩增的核酸包括所有感兴趣的ＳＴＲ以及毗邻ＳＴＲ的核酸的基本邻接的片段。然后获得了单链产物，将靶向（ｉ）ＳＴＲ和（ｉｉ）邻接的ＤＮＡ片段的荧光标记的寡核苷酸与所述单链产物杂交，然后结合于固相并与剩余的靶向物分开。用碱处理回收标记的寡核苷酸靶向物，然后与含有多个斑点的微阵列杂交，所述斑点中含有与所述寡核苷酸靶向物互补的合适的寡核苷酸探针。杂交后，检测微阵列上具体斑点中存在的标记的杂交靶的荧光强度以获得各值，并与已知对照样品的结果比较，以准确定量被分析ＤＮＡ感兴趣区域的ＳＴＲ数目。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术总体涉及用于成人、胎儿和胚胎的遗传或偶发性遗传缺陷的诊断检测，更具体地说涉及由短串联重复(STR)引起的疾病或缺陷的检测，再具体地说涉及引起脆性X染色体综合征(fragile X syndrome)的遗传缺陷的检测。这些STRP检测采用聚合酶链式反应(PCR)，然后与微阵列杂交，并进行分析。
技术介绍
真核生物DNA具有很短的简单序列的串联重复，称为短串联重复多态性(STRP)。重复多态性包括二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复。三核苷酸和四核苷酸重复是3个核苷酸和4个核苷酸的重复。已知越来越多的疾病与三核苷酸STR的扩增有关(Trottier，Y.等，Current Biology 3783-786(1993)；Bates，G.等，Bioassays 16277-284(1994)；Kawaguchi，Y.等，NatureGenetics8221-227(1994))。这些疾病中，重复块的大小往往与疾病的严重程度和发病年龄相关，因此也反映了疾病的严重程度和发病年龄。一些疾病与重复块大小的轻微增加有关，例如，亨廷顿氏病、I型脊髓小脑性共济失调性疾病、脊髓延髓肌肉萎缩症、马-约病和齿状核红核苍白球丘脑下部核萎缩。其它疾病可能包括高达100倍的正常STR的扩增，如A型脆性X染色体、E型脆性X染色体和肌强直性营养不良。已提议了某些基于存在于人基因组的高多态性类型或重复DNA的扩增和检测的诊断和法医检定，例如Craig等，J.Forensic Sci.，第33卷，1111-1126页(1988)；Edwards等，Genomics，第12卷，241-253页(1992)；Boerwinkle等，Proc.Natl.Acad.Sci.，第86卷，212-216页(1989)；Tautz，Nucleic AcidsResearch，第17卷，6463-6471页(1989)等。通常，用聚合酶链式反应(PCR)扩增含有重复序列的DNA片段，然后用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分辨其大小。该方法靶向于称为“短串联重复”或“STR”重复DNA，由于这种DNA的大小和在基因组中的分布，诊断和基因定位应用对其尤其感兴趣。这类DNA中重复单元的长度通常为2-6个核苷酸，这使它们成为PCR扩增和电泳分离的方便靶标。国际申请WO 94/03638公开了同时扩增一个或多个染色体特异性STR的方法，通过电泳分辨大小来分离扩增的STR以及测定各扩增的STR DNA的量；该方法用于确定所选染色体的非整倍性。美国专利申请2003/0224380建议对应于这些重复DNA两侧区域的寡核苷酸可用作扩增小DNA样品的聚合酶链式反应(PCR)引物，该专利申请引用了Saiki，Science 239484-491(1988)。通过用标记的例如放射性或荧光核苷酸扩增DNA，可将样品在测序胶上进行分析，并用已知的方法例如放射自显影图或荧光检测来显像。因为这些多态性包括等位基因，这些等位基因的长度可能只相差几个碱基对，所以据称这些多态性一般不能用常规的(传统的RFLP分析中所用的)Southern印迹检测到。国际申请WO 94/03638揭示了可用扩增的至少3个核苷酸的STR来检测非整倍性。电泳分辨大小来分离扩增的DNA，用可用分光光度计解析的荧光标记来确定相对浓度。有很多遗传疾病属于STRP的范畴。这些疾病包括肌强直性营养不良-CTG重复亨廷顿病和脊髓小脑性共济失调-CAG重复；以脆性X染色体-CGG重复。脆性X染色体综合征是一种X连锁的外显率降低的显性疾病，是遗传智力迟钝的最常见形式之一。该疾病影响大约1/1250的男性和1/2000的女性。患有该疾病的男性和女性的认知、行为和身体表型不同，由于突变的X连锁遗传，它对男人的影响更严重。如其名称所表示的，脆性X染色体是一种X染色体连锁的疾病。脆性X染色体表型的特征是在X染色体近末端处(q27.3)有可见的缢痕，X染色体的尖部在组织培养的某些条件下容易断裂。研究者们已鉴定了与该疾病相关的基因组区域，与脆性X染色体综合征相关的DNA序列(FRAXA基因)揭示于美国专利6,197,500。引起该疾病的突变造成位于Xq27.3的FRAXA 5′非翻译区的CGG重复的扩增。脆性X-CGG重复有4种形式常见(6-40重复)、居间(41-60重复)、前突变(61-200重复)和完全突变(＞230重复)。最终导致脆性X染色体表型的突变往往是分阶段发生的。在早期阶段，该基因还没有完全缺陷，而是“前突变”，前突变携带者可能具有正常表型。但是，在女性携带者中发生的突变可能会在其后代中产生表型。CGG重复数目的增加产生的后果从异常行为到智力迟钝不等。高于正常范围(6-40)的CGG重复数目决定了该综合征的严重程度。多年来，诊断脆性X染色体综合征的唯一途径就是通过组织培养中细胞生长和处理以后显微检查患者个体的染色体。该检查中，实验室将检查X染色体以确定其尖部是否已断裂。早期一些用基于PCR的方法在基因组水平直接鉴定CGG重复序列的尝试均告失败(见E.J.Kremer，″基因定位方法确定脆性X染色体的DNA不稳定性是由三核苷酸重复序列p(CGG)n造成的″，Science，第252卷，Jun.21，1991，1711-1714页)。近期一些诊断方法用PCR和凝胶电泳分离基于分子量来进行鉴定。例如授予Bunn等的美国专利5,213,961公开了一种用竞争方法来进行定量PCR的方法，其中讨论了影响DNA扩增的参数和分辨模板(测试和对照)比率以及拷贝数的区别的机制。该专利提到可用其方法来检测体细胞突变。Bunn等揭示了各种参数对扩增过程的影响，这些参数主要来自DNA引物的性质及它们各自的结合位点等；然而，该系统只限于使用与靶DNA足够接近的标准品从而可以用PCR以相同的比率同时扩增靶标和样品。而且，标准品必须与靶标不同从而后续过程中可通过酶的作用改变其长度，用电泳使标准品和靶标分离并定量。授予Caskey的美国专利6,180,337揭示了一种检测和比较正常和未患病个体中FMR-1基因表达的方法，其中患病个体相对于正常个体FMR-1基因表达的改变表明脆性X染色体突变。该方法试图定量不稳定的mRNA而非稳定的基因组DNA，所以该方法常常造成诊断结果不准确。授予Das的美国专利6,143,504使用甲基特异性PCR以鉴定患有脆性X染色体综合征的男性。然而，该方法只限于诊断具有大于200个重复的完全突变。授予Sutherland的美国专利6,197,500揭示了一种包含人脆性X染色体位点的纯化和分离的DNA分子，该专利教导了用与扩增产物互补的引物杂交(用于鉴定基因组DNA)来检测CGG重复的PCR扩增产物。然而，该专利没有教导如何特异性定量重复的数目从而获得后续的准确诊断结果；它只是暗示使用在合适的严谨度下可与异常序列杂交的引物。美国专利5,658,764和6,200,747公开了一种检测脆性X染色体综合征的方法，其采用了PCR、dGTP的类似物，然后最终用凝胶电泳分离。然而，这些方法在确定CGG重复的数目从而提供准确诊断结果方面的能力是很有限的。原因通常在于PCR扩增CGG重复区域的难度，以及不能产生足够的PCR产物来进行准确的凝本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测脆性Ｘ染色体综合征突变指征的方法，该方法包括以下步骤：（ａ）获得要检测的基因组ＤＮＡ，（ｂ）用ＰＣＲ沿基因组ＤＮＡ中Ｘ染色体扩增核酸，该核酸包括ＦＲＡＸＡ基因非翻译部分的所有ＣＧＧ重复和与所述ＣＧＧ重复毗邻的核酸的基 本邻接区段，（ｃ）从步骤（ｂ）扩增的核酸获得单链产物，（ｄ）将靶向（ｉ）（ＣＧＧ）重复和（ｉｉ）所述邻接核酸区段的比色标记的寡核苷酸与步骤（ｃ）中所述的单链产物杂交，（ｅ）将步骤（ｃ）中所述的单链产物结合于固相， （ｆ）将步骤（ｄ）所述杂交产物与剩余的靶物质分离，（ｇ）从步骤（ｆ）分离的产物中回收标记的靶物质，（ｈ）然后将步骤（ｇ）中回收的标记的靶物质与微阵列杂交，该微阵列具有多个含有合适的与所述靶物质互补的寡核苷酸探针的斑点， （ｉ）与微阵列杂交后，检测微阵列上具体斑点中杂交的标记靶物质的比色强度，以获得各自的数值，和（ｊ）将步骤（ｉ）中的结果与已知对照样品的结果比较，以准确定量获得的基因组ＤＮＡ中ＦＲＡＸＡ基因的ＣＧＧ重复数目。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：S韩，
申请(专利权)人：生物概念股份有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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