本发明专利技术公开一种快速检测灿烂弧菌的方法，有如下步骤：ａ．将２５μｌＰＣＲ反应试剂置入ＰＣＲ管中，反应试剂中的上游、下游引物分别是ＶｓＦ：５′－ＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＴＡＧ－３′；ＶｓＲ：５′－ＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧ－３′；ｂ．将微量的待检测样品放入ａ步骤所述的ＰＣＲ管中，应用ＰＣＲ仪进行扩增反应，反应条件为：９４℃预变性４ｍｉｎ，然后进行如下３０个循环：９４℃变性５０ｓ，５６℃退火５０ｓ，７２℃延伸５０ｓ；最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存；ｃ．取５μｌｂ步骤的ＰＣＲ产物与６×ＰＣＲ上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的１％琼脂糖凝胶电泳中以ＤＮＡ分子量标记对照进行检测。具有检测速度快、灵敏度高、成本低等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种海参等海洋生物致病菌的检测方法，尤其是一种快速检测灿烂弧菌的PCR方法。
技术介绍
近年来，我国海水养殖业发展迅速，但是集约化养殖模式导致海水养殖病害日益严重，暴发起来波及范围广、死亡率高、破坏性大，给国家和养殖户造成严重的经济损失。弧菌是在海水和海洋生物中广泛分布的海水养殖动物主要的条件致病菌，其中病原性弧菌能使养殖生物暴发性死亡，与病毒、其他细菌或寄生虫等一起将会对海水养殖造成巨大的损害，被公认为是海水养殖中最为严重的病害之一，如造成海参幼参大规模死亡(死亡率达20％～50％)的海参腐皮综合症的致病菌主要就是灿烂弧菌。因此，对于灿烂弧菌的检测是防治病害的必要手段之一。目前，对于病菌的检测方法很多，如微生物学、形态学、生物化学和PCR等。其中的PCR方法具有检测速度快、灵敏度高、成本低的优点。但是，由于迄今为止并没有PCR检测方法用于扩增灿烂弧菌的特异引物，所以至今对于灿烂弧菌的检测只是细菌培养、形态学、生物化学等方法，耗时长(2～3天以上)，成本高，检测结果也不十分可靠。
技术实现思路
本专利技术是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种检测速度快、灵敏度高、成本低的快速检测灿烂弧菌的PCR方法。本专利技术的技术解决方案是一种快速检测灿烂弧菌的方法，其特征在于有如下步骤a.将25μlPCR反应试剂置入PCR管中，反应试剂中的上游、下游引物分别是VsF5′-GGACGGGTGAGTAATGCCTAG-3′；VsR5′-GTTAGCCGGTGCTTCTTCTG-3′；b.将微量的待检测样品放入a步骤所述的PCR管中，应用PCR仪进行扩增反应，反应条件为94℃预变性4min，然后进行如下30个循环94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，4℃保存。c.取5μl b步骤的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测。所述的反应试剂的组分如下10×PCR缓冲溶液 2～3μl4mmol/l dNTP 2μlVsF(25pmol/l)1μlVsR(25pmol/l)1μlTaq酶(5U/μl)0.3μl25mmol/l镁离子 1.5μl双蒸水 余量。本专利技术提供了一对扩增灿烂弧菌的特异引物VsF、VsR，从而提供一种快速检测灿烂弧菌的方法，同现有技术相比具有如下优点1.检测速度快，既不用细菌培养也不用萃取核酸，可在2～4小时内得到检测结果；2.灵敏度高，可直接从极少的细菌中扩增并检测到特异条带，无需经过纯培养并且要达到一定量后才可检测；3.成本低，由于无需萃取核酸，即可直接将其合并到PCR热裂解，节省了萃取核酸的费用，降低了检测成本。具体实施例方式a.将25μlPCR反应试剂置入PCR管中，反应试剂的组分如下10×PCR缓冲溶液2～3μl4mmol/l dNTP 2μlVsF(25pmol/l) 1μlVsR(25pmol/l) 1μlTaq酶(5U/μl) 0.3μl25mmol/l镁离子 1.5μl双蒸水 余量。b.将微量的待检测样品放入a步骤所述的PCR管中，应用PCR仪进行扩增反应，反应条件为94℃预变性4min，然后进行如下30个循环94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，4℃保存。c.取5μl b步骤的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记(DL2000)对照进行检测，在紫外灯下存在405bp的核酸片段，则说明有灿烂弧菌。检测原理在PCR预扩增阶段将样品热裂解释放出病原菌的DNA，再与PCR反应试剂和引物一起，用PCR仪对灿烂弧菌特异序列进行扩增。由于本专利技术所设计的引物为灿烂弧菌所特有，因此如果样品中含有灿烂弧菌，那么在扩增后通过1％琼脂糖电泳和溴化乙锭染色后，紫外灯下检测就可看到一个405bp的条带。权利要求1.一种快速检测灿烂弧菌的PCR方法，其特征在于有如下步骤a.将25μl PCR反应试剂置入0.2ml PCR管中，反应试剂中的上游、下游引物分别是VsF5′-GGACGGGTGAGTAATGCCTAG-3′；VsR5′-GTTAGCCGGTGCTTCTTCTG-3′；b.将微量的待检测样品放入a步骤所述的PCR管中，应用PCR仪进行扩增反应，反应条件为94℃预变性4min，然后进行如下30个循环94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，4℃保存。c.取5μl b步骤的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记作为对照进行检测。2.根据权利要求1所述的快速检测灿烂弧菌的PCR方法，其特征在于所述的反应试剂的组分如下10×PCR缓冲溶液 2～3μl4mmol/l dNTP 2μlVsF(25pmol/l) 1μlVsR(25pmol/l) 1μlTaq酶(5U/μl) 0.3μl25mmol/l镁离子1.5μl双蒸水余量。全文摘要本专利技术公开一种快速检测灿烂弧菌的方法，有如下步骤a.将25μlPCR反应试剂置入PCR管中，反应试剂中的上游、下游引物分别是VsF5′－GGACGGGTGA GTAATGCCTAG－3′；VsR5′－GTTAGCCGGTGCTTCTT CTG－3′；b.将微量的待检测样品放入a步骤所述的PCR管中，应用PCR仪进行扩增反应，反应条件为94℃预变性4min，然后进行如下30个循环94℃变性50s，56℃退火50s，72℃延伸50s；最后72℃延伸5min，4℃保存；c.取5μl b步骤的PCR产物与6×PCR上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的1％琼脂糖凝胶电泳中以DNA分子量标记对照进行检测。具有检测速度快、灵敏度高、成本低等优点。文档编号C12Q1/04GK1944681SQ20061013400公开日2007年4月11日 申请日期2006年10月25日 优先权日2006年10月25日专利技术者王秀利, 常亚青, 田春雨, 仇雪梅, 马悦欣 申请人:大连水产学院本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测灿烂弧菌的ＰＣＲ方法，其特征在于有如下步骤：ａ．将２５μｌＰＣＲ反应试剂置入０．２ｍｌＰＣＲ管中，反应试剂中的上游、下游引物分别是：ＶｓＦ：５′－ＧＧＡＣＧＧＧＴＧＡＧＴＡＡＴＧＣＣＴＡＧ－３′；ＶｓＲ：５′－ＧＴＴＡＧＣＣＧＧＴＧＣＴＴＣＴＴＣＴＧ－３′；ｂ．将微量的待检测样品放入ａ步骤所述的ＰＣＲ管中，应用ＰＣＲ仪进行扩增反应，反应条件为：９４℃预变性４ｍｉｎ，然后进行如下３０个循环：９４℃变性５０ｓ，５６℃退火５０ｓ，７２℃延伸５０ｓ；最后７２℃延伸５ｍｉｎ，４℃保存。ｃ．取５μｌｂ步骤的ＰＣＲ产物与６×ＰＣＲ上样缓冲液混合，在加入溴化乙锭染色的１％琼脂糖凝胶电泳中以ＤＮＡ分子量标记作为对照进行检测。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王秀利，常亚青，田春雨，仇雪梅，马悦欣，
申请(专利权)人：大连水产学院，
类型：发明
国别省市：91[中国|大连]
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