一种葡聚糖支链度的测定方法技术

本发明专利技术涉及医药化学的测定技术领域，具体是一种葡聚糖支链度的测定方法，其技术方案是分别通过单位重量的葡聚糖经高碘酸氧化所生成甲酸的生成量a和PMP溶液与单位重量的葡聚糖进行反应的PMP消耗量b进行计算葡聚糖的支链度。本发明专利技术所具有的有益效果是：本发明专利技术以化学方法测定葡聚糖的还原端与非还原端数量，以此来确定葡聚糖中α‑1，6连接糖苷键数量(即支链数)，具体是通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和PMP溶液与单位重量的葡聚糖进行反应的PMP消耗量b进行计算葡聚糖的支链度，与现有技术相比可获得更高的测定精度。

A method for determining the degree of glucan branching chain

The present invention relates to the technical field determination of medicinal chemistry, in particular to a method for determination of dextran branched degree, which is produced by periodate oxidation of formic acid generated by unit weight dextran respectively a and PMP solution and the unit weight of the dextran reaction of PMP consumption calculated B dextran branched degree. The invention has the beneficial effect of the invention is: reducing end determination of dextran by chemical method and non reducing end number, in order to determine the glucan in alpha 1, 6 connected glycosidic bond (i.e. branched number), the number is generated by the specific acid unit weight dextran produced a and PMP solution with the unit the weight of the dextran reaction of PMP consumption calculated B dextran branched degree, compared with the existing technique can achieve higher precision determination.

【技术实现步骤摘要】
一种葡聚糖支链度的测定方法
本专利技术涉及医药化学的测定
，具体是一种葡聚糖支链度的测定方法。
技术介绍
淀粉作为生物大分子多糖混合物，天然淀粉一般含有两种组分：直链淀粉(amylose)和支链淀粉(amylopectin)，支链淀粉线性段以α-1，4连接，分支点以α-1，6连接，对淀粉结构测定的方法现有的文献报道有多种，大致可分为两类：传统的化学方法和波谱学法。传统的化学方法大致有水解、氧化、甲基化、smith降解等，波谱学法大致分为：紫外分光光度法、红外光谱法等。传统化学方法对淀粉的结构分析尤其是对淀粉连接方式的测定步骤繁琐，不易操作，不同方法间测定结构有较大的差异，重现性差。波谱学方法中紫外分光光度法主要以直链淀粉与支链淀粉与碘的复合物最大吸收波长的差异确定其比例，不适合分子量相对较小的葡萄糖聚合物；红外光谱法主要用于对淀粉基团的辨认，不能用于支化度的测定。艾考糊精(α-1，4聚吡喃葡萄糖)是支链玉米淀粉的水解产物，艾考糊精和其他电解质合用在临床上用于腹膜透析。BaxterHealthcarCorporation公司生产的艾考糊精腹膜透析液(商品名EXTRANEAL)于2004年12月20日被美国FDA批准上市。艾考糊精被α-淀粉酶代谢为具有较低程度的寡糖聚合(DP)，包括麦芽糖(DP2)，麦芽三糖(DP3)，麦芽四糖(DP4)和更高分子量多糖。随着葡萄糖聚合物中1，6-连接产物的增加，容易在其体内蓄积而造成伤害，因此美国专利US6077836中公开了一种艾考葡萄糖聚合物的制备方法，其所用原料为干净预先洗涤的淀粉且α-1，6连接小于5％。美国FDA批准的艾考葡萄糖聚合物的说明书的“描述项”明确指出：艾考葡萄糖聚合物主链为α-1，4连接的葡萄糖聚合物，支链为α-1，6连接，并且α-1，6连接物不得超过10％。由此可见艾考葡萄糖聚合物α-1，6连接的测定对于产品的安全性就变得极为重要。但是现有的测定方法均存在着测定精度低的缺陷，比如双波长测定法，碘染色最大吸收波长变化，双波长测定方法受对照品影响较大，且由于分子量的变化对葡聚糖支链度测定不适用；核磁碳谱测定方法由于碳原子响应值低，峰重合等影响测定的准确性；核磁氢谱测定方法由于不同位置氢原子的响应值有差异，造成不能避免的测定误差。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种具有高准确度、测定误差小的葡聚糖支链度的测定方法。本专利技术的具体技术方案是：一种葡聚糖支链度的测定方法，包括分别通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和衍生试剂与单位重量的葡聚糖进行中和反应的PMP消耗量b进行计算葡聚糖的支链度。优选地，所述单位重量的葡聚糖所生成甲酸量a的计算方法是通过葡聚糖在缓冲溶液中被高碘酸钠氧化，制备葡聚糖氧化待测液，然后利用色谱仪进行测量计算甲酸的生成量a。优选地，所述单位重量的葡聚糖与衍生试剂反应，衍生试剂消耗量b的计算方法是通过葡聚糖在碱性溶液中与衍生试剂溶液反应，加入盐酸溶液进行中和反应后利用色谱仪进行测量计算衍生试剂消耗量b。优选地，所述葡聚糖氧化待测液的制备方法是取高碘酸钠溶液与葡聚糖溶液混合后加入缓冲溶液，混合摇匀后置于0-10℃的环境中反应，反应结束后即得葡聚糖氧化待测液，其中所述葡聚糖的质量与高碘酸钠的质量之比为1∶0.5-5。优选地，所述葡聚糖氧化待测液的制备方法是取葡聚糖加入缓冲溶液混合后加入高碘酸钠溶液混合摇匀后，置于0-10℃的环境中反应72-240小时。优选地，所述衍生试剂为3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮、3-氨基-9-乙基咔唑、对氨基苯甲酸乙酯、2，6-二氨基吡啶、苯二铵中的任一种。优选地，所述缓冲溶液为醋酸三乙胺缓冲液、磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、巴比妥盐缓冲液、tris缓冲液、硼酸盐缓冲液中的任一种。优选地，所述对葡聚糖氧化待测液测量计算甲酸的生成量a的计算方法为外标法，通过测得反应液甲酸峰面积与已知浓度对照品峰面积比较，得出待测样品的甲酸浓度C(ug/ml)和单位重量葡聚糖产生甲酸量。优选地，测量所述单位重量的葡聚糖与衍生试剂反应的PMP消耗量b的方法包括向单位重量的葡聚糖溶液中加入氢氧化钠溶液、PMP甲醇溶液、混合后水浴70℃反应，冷却至室温后加入盐酸进行中和，稀释后即得待测液。优选地，所述葡聚糖为艾考糊精。本专利技术与现有技术相比，所具有的有益效果是：本专利技术以化学方法测定葡聚糖的还原端与非还原端数量，以此来确定葡聚糖中α-1，6连接糖苷键数量(即支链数)，具体是通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和PMP溶液与单位重量的葡聚糖进行中和反应的PMP消耗量b进行计算葡聚糖的支链度，与现有技术相比可获得更高的测定精度。具体实施方式为能清楚说明本方案的技术特点，下面通过具体实施方式，对本专利技术进行详细阐述。本专利技术实施例公开了一种葡聚糖支链度的测定方法，包括分别通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和3-基-2-吡唑啉-5-酮(即PMP，以下简称PMP)溶液与单位重量的葡聚糖进行中和反应的PMP消耗量b来确定葡聚糖中还原端与非还原端的数量，从而进行计算葡聚糖的支链度，且计算公式为：支链度＝(a-b)×0.001×163×100％，其中a与b的单位为mmol。进一步的，在本专利技术中采用高效液相色谱法对所述单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a进行计算，具体计算方法是通过高碘酸钠、葡聚糖溶液和醋酸三乙胺缓冲溶液混合制备葡聚糖氧化待测液然后利用色谱仪进行测量计算甲酸的生成量a。此外，在本专利技术中，3-基-2-吡唑啉-5-酮(PMP)可以用3-氨基-9-乙基咔唑、对氨基苯甲酸乙酯、2，6-二氨基吡啶、苯二铵等衍生试剂进行代替。进一步的，本专利技术中采用高效液相色谱法对所述单位重量的葡聚糖进行中和反应的PMP消耗量b进行计算，具体计算方法是通过葡聚糖溶液、氢氧化钠溶液、PMP甲醇混合溶液反应后加入盐酸溶液进行反应后利用色谱仪进行测量计算PMP消耗量b。进一步的，所述葡聚糖氧化待测液的制备方法是取高碘酸钠溶液与葡聚糖溶液混合后加入醋酸三乙胺缓冲溶液，混合摇匀后置于0-10℃的环境中反应，反应结束后即得葡聚糖氧化待测液，其中所述高碘酸钠的质量、葡聚糖的质量、醋酸三乙胺的物质的量之为0.6-1：0.3-0.7：0.05-0.09。此外，该步骤中的缓冲溶液有多种替代方案，如：磷酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、巴比妥盐缓冲液、tris缓冲液、硼酸盐缓冲液。进一步的，所述高碘酸钠的质量、葡聚糖的质量、醋酸三乙胺的物质的量之为0.8：0.5：0.07。进一步的，所述利用色谱仪对葡聚糖氧化待测液测量计算甲酸的生成量a时的色谱条件为色谱柱：KromasilC185u100ALotNo60104KSerialNo09254243和KromasilC185u100ALotNo60104KSerialNo09254245串联；流速：0.6ml/min；柱温：40℃；检测波长：215nm；流动相：A：乙腈，B：0.1M磷酸盐缓冲液；pH2.7。进一步的，所述对葡聚糖氧化待测液测量计算甲酸的生成量a的计算方法为外标法，通过测得的葡聚糖反应液中甲酸峰面积与已知浓度甲酸对照品峰面积比较，得出待测样品的浓度C(ug/ml)，得到反应后体系里甲酸钠物质的量N(umol)，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，分别通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和衍生试剂与单位重量的葡聚糖进行反应的PMP即3‑甲基‑1‑苯基‑2‑吡唑啉‑5‑酮的消耗量b进行计算葡聚糖的支链度。

【技术特征摘要】
1.一种葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，分别通过单位重量的葡聚糖所生成甲酸的生成量a和衍生试剂与单位重量的葡聚糖进行反应的PMP即3-甲基-1-苯基-2-吡唑啉-5-酮的消耗量b进行计算葡聚糖的支链度。2.根据权利要求1所述的葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，所述单位重量的葡聚糖所生成甲酸量a的计算方法是通过葡聚糖在缓冲溶液中被高碘酸钠氧化，制备葡聚糖氧化待测液，然后利用色谱仪进行测量计算甲酸的生成量a。3.根据权利要求1所述的葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，所述单位重量的葡聚糖与衍生试剂反应，衍生试剂消耗量b的计算方法是通过葡聚糖在碱性溶液中与衍生试剂溶液反应，加入盐酸溶液进行中和反应后利用色谱仪进行测量计算衍生试剂消耗量b。4.根据权利要求2所述的葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，所述葡聚糖氧化待测液的制备方法是取高碘酸钠溶液与葡聚糖溶液混合后加入缓冲溶液，混合摇匀后置于0-30℃的环境中反应，反应结束后即得葡聚糖氧化待测液，其中所述葡聚糖的质量与高碘酸钠的质量之比为1∶0.01～10。优选1∶0.5～5。5.根据权利要求4所述的葡聚糖支链度的测定方法，其特征在于，所述葡聚糖氧化待测液的制备方法是取葡聚糖加入缓冲溶液混合后加入高碘酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐茂华，王文彦，孙建，
申请(专利权)人：青岛力腾化工医药研究有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37