本发明专利技术公开了一种分析浮游生物群落ＤＮＡ多态性的方法，其步骤是：Ａ．样品采集；Ｂ．浮游生物群落ＤＮＡ提取；Ｃ．随机扩增多态性ＤＮＡ分析；Ｄ．浮游生物群落核糖体ＲＮＡ基因的ＰＣＲ扩增及变性梯度凝胶电泳分析；Ｅ．利用Ｑｕａｎｔｉｔｙ Ｏｎｅ软件对图谱进行定性、定量分析，计算各样点浮游生物群落ＤＮＡ多态性的相似性。本发明专利技术具有技术路线程序化、比较分析规范化的特点，并且操作简便，能够快速、有效地对多个样品平行进行分析。因此，克服了人为因素的影响、增强了不同时空研究间的可比性，这能为探求生态学机理提供可靠的前提。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及宏基因组领域微生物群落结构研究，更具体涉及一种分析浮游生 物群落DNA多态性的方法，即通过RAPD、 PCR-DGGE分析浮游生物群落DNA 多态性以反映其群落结构及其时空变化。
技术介绍
生物多样性是生物及其与环境所组成系统的多样性和变异性，它本质上是一 种具有多重价值、高度综合的资源形式，是人类生存和社会发展的物质基础。它 在维持生态系统稳定、提高生态系统生产力、实现生态系统可持续发展等方面均 起着重要的作用。因此，自人类文明以来生物多样性就被广泛关注与研究。其中 以形态分类为基础的物种多样性研究是最早涉及的，可追溯至列文虎克。现已定 名或描述的物种约140万(或170万)种，而这与地球上可能存在的物种数相比， 还只是很少的一部分。遗传多样性作为生物多样性的基础，同样也受到了广泛的 关注，尤其是在个体和种群层面(即狭义的遗传多样性)。生物多样性的各层次 间是相互依赖的有机体，对高层次结构与功能的认识需要以对低层次结构的了解 为前提。因此，对生态系统多样性的全面认识是以物种及遗传多样性为基础的。随着分子生物学和分子生态学的快速发展，分子技术在分类学和生态学研究 中逐渐开始担当起重要角色，并有可能成为跨越形态鉴定而连接群落遗传结构与 物种构成的桥梁。近20年来，群落层面遗传多样性(即广义的遗传多样性)的 研究取得了重要进展。其中，1998年宏基因组(metagenome)概念的提出是一个 重要的里程碑。通过宏基因组技术直接对环境样品的研究使我们逐渐认识到环境 中存在着众多"新的"微生物，它们不论是在数量上还是在种类上都使得那些可 培养的微生物相形见绌。很显然，那些现有技术无法培养生物的生态功能是相当重要的，但它们的不可培养性极大地制约了我们对生态规律的认识。宏基因组学 (Metagenomics)的发展突破了这一制约而使得通过现代分子生物学直接对自然 群落的研究成为可能。事实上，特定物种基因组研究实现了从单一基因到基因集 合认识的转变，宏基因组研究则摆脱了物种的界限，它包含了远比那些可培养类 群更海量的信息。这为研究复杂微生物群落及其功能提供了很好的策略，进而有 可能揭示更高、更复杂层次生命系统运行的内在规律。随机引物扩增多态性DNA (RAPD)由于操作简便、可供选择的引物多、且 不需预知模板序列信息，已被广泛应用于遗传多样性研究。变性梯度凝胶电泳 (DGGE)作为指纹分析技术的重要代表，自1993年被应用到细菌多样性研究 以来，它在生物多样性和系统进化研究中备受青睐，尤其是在原核微生物群落研 究方面，关于真核微生物群落方面的报道相对较少。而浮游生物作为悬浮于水中 的微小生物，其数量大、分布广、种类组成复杂，是生物多样性的重要组成部分， 同时也由于它在水体生态系统中司重要的生态功能而被普遍认为是水环境监测 的重要生物类群。但由于其个体小、形态分类特征不明显这一瓶颈制约大大限制 了人类对它们的认识，有些甚至还无法通过形态来鉴定。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种分析浮游生物群落DNA多态性的方法，方 法易行，操作简便，能够快速，有效地对多个样品平行进行分析，该方法不受形 态分类的瓶颈制约，利用RAPD、 PCR-DGGE技术直接对浮游生物群落DNA(宏 基因组)进行分析。以浮游生物群落总DNA指纹结构表征生物群落组成，使不 同时空间研究数据处理方便快捷且便于进行比较分析，有效地提高了工作效率。本专利技术通过以下技术方案实现，其具体步骤是1. 样品采集用有机玻璃采水器(中科院水生生物研究所玻璃仪器厂)分别采集等体积的 表、底层水混合，水样经充分混匀后用GF/C滤膜(Whatman,英国)过滤0.2-0.5L水样。2. 浮游生物群落DNA提取将过滤后的GF/C滤膜在无菌的条件下剪碎(约lxl mm碎片)，并浸没于装有3 mL裂解缓冲液(0.5% SDS， 10 mM Tris-Cl， 100 mM EDTA， 0.1 mg/mL蛋 白酶K)的离心管中，55。C水浴裂解10h。 10000r/min离心5min (20°C)后将 上清转入一新的离心管，同样条件下再次离心取上清经等体积的酚一酚氯仿 (1: 1)—氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇(含0.3M的NaCl)于-2(TC沉 淀3 h。 13000 r/min离心10 min (-4。C)后去上清并用70%的乙醇清洗3次，每 次清洗完于13000 r/min离心10 min (-4。C )、弃上清，自然干燥后加入20-50 TE溶解，DNA存于-20'C备用。3. 随机扩增多态性DNA (RAPD)分析，其特点如下 首先对PCR反应体系中的DNA、 Mg2+、 dNTP、 Taq酶及引物浓度和循环参数进行优化，进而用优化好的条件从2-5组随机引物(每组20条)筛选出扩增 结果稳定、谱带清晰、多态性好的7-10条随机引物对浮游生物群落总DNA进行 PCR扩增。在25 (iL体系中包含约50-100 ng DNA， 1 x Buffer, 2 mM Mg2+， 80 dNTP， 0.8pM10个碱基长度的随机引物，1.5UTaq酶，混匀后稍离心将反应液 集中于管底进行以下扩增94'C预变性5min，后接45个循环(每个循环依次包 含94。C45s, 36°C 60s, 72°C 120 s)，最后于72。C延伸5 min，反应终止于4。C。 PCR产物(7-10 ^L)用1.4%-2.0%的琼脂糖凝胶(含0.5吗/mL EB)进行电泳 分离、UVP成像分析系统拍照。4. 浮游生物群落核糖体RNA基因(rDNA)的PCR扩增及变性梯度凝胶电 泳(DGGE)分析，其特点如下分另採用针对16S扁A的弓I物(正向弓l物Pl- 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGC GCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCCCCTACGGGAGGCAGCAG-3 ，；反向弓1物P2: 5'-ATTACCGCGGCTGCTGG-3 ，)和18S rDNA的引物(正向引物P3: 5 ，-CGCCCGCGTTCTGGG-3,; 反向引物P4: 5,-GCGGTGTGTACAAAGGGCAGGG-3，)对浮 游生物群落DNA进行PCR扩增。50 ^L体系中含有约40-100 ng DNA， lx PCR Buffer, 2mMMg2+， 80^MdNTP， 3.0UTaq酶，正、反向引物各0.3 nM。反应 物混匀后稍离心将反应液集中于管底进行如下扩增94'C变性5 min后进行递减 (touchdown) PCR，每个循环94。C变性30 s，退火30 s (Pl + P2弓l物67。C-58 °C IO个递减循环，然后于57。C进行20个循环；P3 + P4引物69°C-60°C IO个递减循环，然后于59"进行18个循环)，72。C延伸60s，最后于72"延伸10 min，反 应终止于4。C。通过1.4%-2.0%琼脂糖凝胶(含0.5pg/mLEB)电泳确认目的片段 并确定后续变性梯度凝胶电泳(DGGE)的上样量(15-30 pL)。等量的PCR产物 用9。/。的丙稀酰胺通过INGENYphorU-2系统进行变性梯度凝胶电泳，变性剂梯度 范围为40%-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分析浮游生物群落ＤＮＡ多态性的方法，其步骤是：Ａ、样品采集：用有机玻璃采水器分别采集等体积的表、底层水混合，水样混匀后用ＧＦ／Ｃ滤膜过滤０．２－０．５Ｌ水样；Ｂ、浮游生物群落ＤＮＡ提取：将过滤后的ＧＦ／Ｃ滤膜在无菌的条件下剪碎，并浸没于装有３ｍＬ裂解缓冲液的离心管中，裂解缓冲液成分为０．５％ＳＤＳ，１０ｍＭＴｒｉｓ－Ｃｌ，１００ｍＭＥＤＴＡ及０．１ｍｇ／ｍＬ蛋白酶Ｋ；５５℃水浴裂解１０ｈ，１００００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ后将上清转入一新的离心管，再次离心取上清经等体积的酚→酚∶氯仿（１∶１）→氯仿三次抽提后用预冷的无水乙醇于－２０℃沉淀３ｈ，１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ后去上清并用７０％的乙醇清洗３次，每次清洗完于１３０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ、弃上清，干燥后加入２０－５０μＬＴＥ溶解，ＤＮＡ存于－２０℃备用；Ｃ、随机扩增多态性ＤＮＡ分析：首先对ＰＣＲ反应体系中的ＤＮＡ、Ｍｇ↑［２＋］、ｄＮＴＰ、Ｔａｑ酶及引物浓度和循环参数进行优化，其次是从２－５组随机引物筛选出扩增结果稳定、谱带清晰、多态性好的７－１０条随机引物对浮游生物群落ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增；在２５μＬ体系中包含５０－１００ｎｇＤＮＡ，１×Ｂｕｆｆｅｒ，２ｍＭＭｇ↑［２＋］，８０μＭｄＮＴＰ，０．８μＭ１０个碱基长度的随机引物，１．５ＵＴａｑ酶，混匀后离心将反应液集中于管底进行以下扩增：９４℃预变性５ｍｉｎ，后接４５个循环，最后于７２℃延伸５ｍｉｎ，反应终止于４℃，ＰＣＲ产物用１．４％－２．０％的琼脂糖凝胶进行电泳分离、ＵＶＰ成像分析系统拍照；Ｄ、浮游生物群落核糖体ＲＮＡ基因的ＰＣＲ扩增及变性梯度凝胶电泳分析：分别采用针对１６ＳｒＤＮＡ的引物和１８ＳｒＤＮＡ的引物对浮游生物群落ＤＮＡ进行ＰＣＲ扩增，５０μＬ体系中含有４０－１００ｎｇＤＮＡ，１×ＰＣＲＢｕｆｆｅｒ，２ｍＭＭｇ↑［２＋］，８０μＭｄＮＴＰ，３．０ＵＴａｑ酶，正、反向引物各０．３μＭ，反应物混匀后离心将反应液集中于管底进行如下扩增：９４℃变性５ｍｉｎ后进行递减ＰＣＲ，每个循环９４℃变性３０ｓ，低温退火３０ｓ，７２℃延伸６０ｓ，最后于７２℃延伸１０ｍｉｎ，反应终止于４℃，通过１．４％－２．０％琼脂糖凝胶电泳确认目的片段并确定后续变性梯度凝胶电泳的上样量，等量的ＰＣＲ产物用９％的丙稀酰胺通过ＩＮＧＥＮＹｐｈｏｒＵ－２系统进行变性梯度凝胶电泳，变性剂梯度范围为４０％－６０％，６０℃恒定...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：余育和，颜庆云，冯伟松，
申请(专利权)人：中国科学院水生生物研究所，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]
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