鉴定西花蓟马的巢式ＰＣＲ方法及特异引物技术

本发明专利技术属于分子生物技术领域，特别是涉及到一种鉴定西花蓟马的巢式ＰＣＲ方法及其特异引物。一种鉴定西花蓟马的巢式ＰＣＲ方法，其特征是ＰＣＲ反应分两步，第一步以ｒＤＮＡ为模板用通用引物扩增出１８Ｓ至２８Ｓ区段，第二步反应以第一步ＰＣＲ产物为模板，再根据１８Ｓ至２８Ｓ区间变异区段序列设计的特异引物Ｆ１、Ｆ２，进行第二轮反应，扩增西花蓟马特有的片段，两轮ＰＣＲ反应提高了鉴定的准确性，改进为单管巢式ＰＣＲ后，提高了鉴定效率，经实验验证，本发明专利技术提供的特异引物能在亲缘关系很近的模板之间准确地鉴定出西花蓟马。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物
，涉及一种能够特异鉴定西花蓟马的巢式PCR方法及特异 引物。 技术背景西花蓟马是一种世界性的危险性害虫，起源于北美洲西部山区，最早记载于1895年，曾是美国加州最常见的一种蓟马，近年来侵入中国部分地区，被国内有关专家确定为危险性外来入侵害虫。西花蓟马直接取食危害，造成蔬菜、花卉及水果等叶片、花器或果面上留下疤痕及斑点。此外，西花蓟马还能传播番茄斑点萎蔫病毒等在内的多种病毒，且在若虫取食植物30分钟后即可获毒，然后主要由成虫传播。目前已知其寄主植物多达500余种，包括重要的菊科、葫芦科、豆科、十字花科等蔬菜作物，尤其是温室种植的花卉、茄果类植物受害最重，因此采取措施防止西花蓟马对植物的危害非常迫切。但由于其卵、若虫、成虫都有很强的隐蔽性，对药剂容易产生抗药性，而常规的防治措施难以奏效，所以在防治及检疫工作中，早期鉴定出西花蓟马并提早防治非常有现实意义。目前为止，蓟马种类的鉴定主要以雌成虫的形态特征为主，但是西花蓟马的成虫体色具多态性---黑色、褐色和黄色，同时蓟马的若虫、蛹无法通过形态鉴定到种，目前也有对未成熟时期的卵、若虫或蛹进行分类的研究，但仍在研究阶段，尚无明确定论。然而在植物检疫过程当中，发现标本为若虫时，通常须继续饲养至成虫才能够鉴定。这样，不仅耗时，且虫体微小，常常在饲养过程中可能死亡或不明原因消失。因此很有必要开发一种快速、简单且准确的鉴定技术。以PCR技术为基础分子标记技术，能很好地解决这些问题。近年来，利用分子标记技术鉴别昆虫种类的研究非常多，可利用的标记技术也非常多，但由于分析样品的特殊性，对于选择哪种分子标记技术却很重要。在DNA分子标记技术的应用过程中，若所研究的昆虫DNA资料未知的情况下，利用RAPD-PCR技术是最简便、最快速，且需要的DNA量少，可用于各种保存方式的标本，也可做特定害虫的快速鉴定(De Barro P J,Driver F. Use ofRAPD-PCR to distinguish the B biotype from other biotypes of Bemisia tabaci (Gennadius)(Hemiptera: Aleyrodidae). Austrilian Journal of Entomology. 1997, 36 (2): 149-152; Garner K J，Slavicek J M. Identification and characterization of a RAPD-PCR marker for distinguishing Asianand North American gypsy moths. Journal of Insect Molecuar and Biology, 1996, 5 (2): 81-91;Haymer D and Mclnnis D. Resolution of populations of the Mediterranean fruit fly， Ceratitiscapitata, at the DNA level using random primers for the polymerase chain reaction. Genome 1994, 37:244-248)。然而这种鉴定技术的开发需要收集完整的鉴定样品作为对照，否则无法建立完 整的分子标记技术；为弥补样品不足的缺陷，直接由已知序列设计引物进行PCR检测目的基 因，不失为一有用的方法。根据文献18S和28S rDNA在所有生物中具有功能上和进化上的 同源性，其整体结构和核酸序列在物种间非常保守，再加上中间包含保守区和变异区，适合 于不同层次上的分类分析(Hillis D M and Dixon M T. Ribosomal DNA: molecular evolution and phylogenetic inference. Quarterly Review of Biology, 1991， 66， 411-453 ; Cruickshank 肌Molecular markers for the phylogenetics of mites and ticks. Systematic and Applied Acarology. 2002, 7: 3-14)。然而在实际的分类鉴定实验中，由于我们得到的标本量少至单头虫体，而蓟 马体形微小，单头提取的DNA浓度很低，即使运用上述分子鉴定方法，也经常因为模板量太 少而使鉴定工作难以顺利进行。有研究者以线粒体DNA为分析模板，设计出特异鉴定出西花 蓟马的特异引物，但由于线粒体DNA在细胞中含量较低，在实际鉴定实验中需要3-4头虫体 才能完成鉴定(周力兵，刘忠善，李春艳，丁元明PCR法鉴定西花蓟马，植物检疫，2007， 21 (2): 78-81)。
技术实现思路
针对上述领域中的空白及存在的问题，本专利技术提供一种能快速、精确鉴定出西花蓟马的 巢式PCR方法以及一对能特异鉴定出西花蓟马的PCR引物。一种鉴定西花蓟马的特异引物F1、 F2，其序列为 Fl : 5,陽GTTCCCGAGTTCGTGATTGC-3'， F2 : 5'陽GGAAGCGGTGAAGCGACCAC-3。一种鉴定西花蓟马的巢式PCR方法，其特征是PCR反应分两步，第一步以rDNA为模 板用通用引物扩增出18S至28S区段，第二步反应以第一步PCR产物为模板，用特异引物 Fl、 F2扩增西花蓟马特有的片段。所述通用引物为CS249， CS250,其序列分别为 CS249: 5，-TCGTAACAAGGTTTCCG-3，。 CS250: 5'-GTT(A/G)GTTTCTTTTCCT-3，。所述巢式PCR方法是双管巢式PCR反应或单管巢式PCR反应。所述巢式PCR方法是单管巢式PCR反应。经过同源比对分析西花蓟马与花蓟马之间高度保守的18S和28S rDNA区间，搜寻到变 异区段，根据变异区段的序列信息设计出一对能特异地扩增出西花蓟马的特异引物F1、 F2，因此本专利技术应用通用引物通过巢式PCR第一步反应将18S部分+ITSl+5.8S+ITS2+28S部分从 基因组中大量扩增出来，然后在此基础上应用特异引物F1、 F2进行巢式PCR第二步反应， 避免了特异引物F1、 F2扩增基因组别的区段，使鉴定结果更为准确，提高了所设计引物的专 一性。由于本专利技术所要鉴定的西花蓟马，非常难于获得大量的样本，很多时候少至单头，所 以提出的DNA量极少，rDNA在细胞中含量高，容易获得，以rDNA作为分析的材料，以通 用引物扩增出18S至28S区段作为次级模板，再利用特异引物特异性扩增西花蓟马，即使只 有一只虫体也能顺利鉴定出西花蓟马，而不像利用线粒体DNA作模板时需要3—4头虫体才 能完成检测。另外在本专利技术中，巢式PCR由常规的双管反应演变出了单管反应，单管反应对于实际的 鉴定操作的快速、准确性提供了进一步的保证，特别是在海关检疫或者植物病害诊断中，准 确性和高效率常常很重要，单管巢式反应可以避免倒换样品时造成模板污染和时间浪费。综上所述，本专利技术提供了一种巢式PCR方法和一对特异引物，以蓟本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定西花蓟马的特异引物Ｆ１、Ｆ２，其序列为：Ｆ１：５’－ＧＴＴＣＣＣＧＡＧＴＴＣＧＴＧＡＴＴＧＣ－３’，Ｆ２：５’－ＧＧＡＡＧＣＧＧＴＧＡＡＧＣＧＡＣＣＡＣ－３。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：吴青君，张治军，徐宝云，张友军，
申请(专利权)人：中国农业科学院蔬菜花卉研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]