一株降解桔霉素的酵母菌及应用制造技术

本发明专利技术公开了一株降解桔霉素的酵母菌及应用，属于生物技术领域，经鉴定为隐球酵母(Cryptococcus podzolicus Y3)，保藏菌株编号为CCTCC NO:M2017505。该隐球酵母对桔霉素降解效果最佳的条件为：酵母初始浓度为10

A yeast that degrade citrinin and its application

The invention discloses a degrading citrinin yeast and its application, and belongs to the field of biotechnology, identified as Cryptococcus yeast (Cryptococcus Y3, podzolicus) preservation strains numbered CCTCC NO:M2017505. The optimum conditions for the degradation of citycomycin by Cain were: the initial concentration of yeast was 10

【技术实现步骤摘要】
一株降解桔霉素的酵母菌及应用
本专利技术属于生物降解毒素的方法，尤其涉及CryptococcuspodzolicusY3酵母在饲料和食品安全等领域的应用。
技术介绍
桔霉素(CIT)是一种具有肾毒性的真菌次级代谢产物，其纯品是一种酸性柠檬黄针状晶体，分子式为C13H14O5，结构式为5-甲基-6-氧代3-2-苯并唑-7-羧基，熔点为172℃，极性低，但脂溶性很高，易溶于甲醇，乙腈等大多有机溶剂中。其特殊结构决定了CIT具有毒性，主要由青霉，曲霉和红曲霉属产生。PK15细胞(猪肾细胞)测试CIT的毒性实验表明，CIT浓度大于50mol/L时，细胞钙平衡会发生紊乱，造成PK15死亡现象。还有文献报道CIT会造成肾脏，肝和骨髓等细胞内线粒体膜渗透功能出现障碍和氧化还原系统的紊乱。欧洲食品安全局(EFSA)指出当前CIT的风险评估尚不准确，需进行更多研究。CIT不仅毒性高，而且污染范围十分庞大。青霉菌污染的有根蕨类蔬菜，水果，谷物，果仁等；红曲霉污染的有大米，燕麦等谷物类以及红曲产品等。其中红曲产品污染最为严重，检测到的CIT含量为0.23-20.65μg/g，超过了日本的限量标准(0.2μg/g)以及欧盟的限量标准(2μg/g)。同时CIT稳定性很高，一般的食品加工条件不会完全消除其在食物中的残留，增加了人类接触的风险性，例如，Mol等在法国谷类早餐中检测到CIT，含量为0.0015-0.042μg/g。Bertuzzi等研究发现CIT浓度超过0.003μg/g的栗子占总样品(烘干)的8％。此外，研究还发现桔霉素可以与赭曲霉素A(OTA)，展青霉素(PAT)发生协同增强作用，提高彼此的毒性。有研究发现CIT与OTA协同作用的机制之一是CIT更易与OTA浓度调节蛋白hOAT4结合(人类有机阴离子转运蛋白)，使游离OTA累积，从而两种毒素混合后，在两种毒素浓度都低的情况下就可引起更强的肾毒性，但更多的协同作用机制还不明确，仍需进一步研究。控制CIT的传统方法包括改变物理环境和添加外源化合物。改变物理环境是通过控制物理因素包括水分，温度、光照和pH等来达到降低CIT含量的方法。添加外源化合物即指通过人为添加外源化合物，控制CIT产生菌的生长，间接减少CIT的产生。然而有诸多缺陷影响实际生产应用：(1)影响食品的感官物性。例如，改变pH以及添加某些外源杀菌物质，会造成原有色香味的改变，影响食品的销售。(2)造成污染。化学方法中的各种农药等杀菌剂的使用会造成很多严重的后果，如药物残留、产生抗性、污染环境等。(3)设备费用高昂。例如辐照与冷藏的方法，效果虽然很好，但是设备费用高昂，推广全面使用困难。(4)应用具有一定的局限性。例如一些冷加工类产品，如果蔬保藏等不适合高温处理。(5)效率低。某些食品加工之前，很多原材料已被CIT污染，而这些加工方法对已经存在的CIT并不能起到全部去除的作用，这也是其最大的缺陷。因此需要寻找更为有效的方法来控制食品中CIT的污染。随着生物脱毒技术的发展，采用微生物控制食品及饲料产品中桔霉素的污染展现出良好的应用前景，但相关研究在国际范围内目前尚处于起步阶段，影响了生物防治技术在桔霉素控制方面的应用。本专利技术的目的是提供一株分离自生态果园的的土壤中，能够高效降解桔霉素的酵母菌株，因其具有的高安全性，利用该菌株可实现对食品、饲料及其制品中的桔霉素的控制，保障了人类食品的食用安全性。试验菌经鉴定为一种隐球酵母(Cryptococcuspodzolicus)，命名为C.podzolicusY3。研究证明，该菌能够显著地降解桔霉素。
技术实现思路
本专利技术所提供的菌株系从镇江市葡萄园土壤中筛选分离得到的一株隐球酵母(C.podzolicusY3)，对桔霉素具有显著降解作用。本专利技术使用的隐球酵母(C.podzolicusY3)，经ICR小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害。本专利技术采用的技术方案本专利技术所提供的降解桔霉素的隐球酵母(C.podzolicusY3)系从镇江市葡萄园土壤中筛选分离得到，在NYDB培养基中28℃培养，进行形态学观察；对该菌株的5.8SrDNA-ITS区序列分析，进行分子生物学鉴定。其中所述的菌株Y3为隐球酵母(Cryptococcuspodzolicus)，系本实验室筛选得到，现保存于位于中国武汉的武汉大学(武昌区八一路珞珈山)的中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏菌株编号为CCTCCNO:M2017505，保藏日期为2017年9月14日，建议的分类名称为CryptococcuspodzolicusY3。本专利技术所提供的隐球酵母Y3的培养方法，按照下述步骤进行：固体培养基采用NYDA，培养温度26℃-28℃，时间48h，所述的培养基组成为牛肉膏8g，酵母浸出物5g，葡萄糖10g，琼脂20g，蒸馏水1000mL；液体发酵培养，采用发酵培养基NYDB，所述NYDB液体培养基组成除不含琼脂外，其他成分同NYDA培养基；利用隐球酵母Y3对桔霉素进行降解的方法，按照下述步骤进行：酵母初始浓度为108cells/mL，pH为6，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm。当桔霉素初始浓度为5μg/mL时，42h后酵母对其降解率为77％；当桔霉素初始浓度为10μg/mL时，42h后酵母对其降解率为96％；当桔霉素初始浓度为20μg/mL时，42h后酵母对其降解率为98％；在21h-28h内，降解效率最高。本专利技术的优点：(1)本专利技术所使用的隐球酵母Y3，系从生态果园的土壤中筛选得到，可高效降解桔霉素，降解率可达98％；且当桔霉素初始浓度为20μg/mL时，21-35h内酵母对其降解速率最快。(2)本专利技术使用的隐球酵母Y3，经ICR小鼠急性毒性试验，确定其具有高度安全性，对人体无害，因此可应用于控制食品，饲料及其制品等中的桔霉素污染，保障食品，饲料及其制品等的食用安全性。通过借助以下实施实例将更加详细的说明本专利技术。以下实施例仅是说明性的，本专利技术并不受这些实施实例的限制。附图说明图1：本专利技术隐球酵母Y3ITS区序列进化关系图；图2：隐球酵母Y3对桔霉素的降解效果；图3：不同浓度的隐球酵母Y3对桔霉素的降解能力；注：10^9：1×109cells/mL隐球酵母菌悬液；10^8：1×108cells/mL隐球酵母菌悬液；10^7：1×107cells/mL隐球酵母菌悬液；10^6：1×106cells/mL隐球酵母菌悬液；图4：不同培养温度下隐球酵母Y3对桔霉素的降解能力；图5：不同pH下隐球酵母Y3对桔霉素的降解能力；图6：隐球酵母Y3对不同初始浓度的桔霉素的降解作用；具体实施方式实施例1：降解桔霉素酵母菌的筛选，具体实施步骤如下：1、从环境中分离酵母单菌落取葡萄园土壤1g，加入装有10mL无菌水的离心管中，充分震荡混匀，取混匀液，做梯度稀释(10-4，10-5，10-6，10-7)，涂布在NYDA培养基平板上，28℃培养20-36h。挑取优势酵母单菌落，在NYDA平板上纯化培养。将分离并纯化后的菌株接种至NYDA斜面，28℃培养48h，置于4℃冰箱短期保藏备用。2、桔霉素测定方法采用高效液相-荧光检测器的方法(HPLC-FLD)检测桔霉素，条件如下，色谱柱：安捷伦C18柱(5.0μ本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株降解桔霉素的酵母菌，保藏编号：CCTCC NO:M2017505；建议的分类名称为Cryptococcus podzolicus Y3。

【技术特征摘要】
1.一株降解桔霉素的酵母菌，保藏编号：CCTCCNO:M2017505；建议的分类名称为CryptococcuspodzolicusY3。2.利用权利要求1所述的隐球酵母(Cryptococcuspodzolicus)对桔霉素进行降解的方法，按照下述步骤进行：酵母初始浓度为108cells/mL，pH为4，摇床培养温度为28℃，转速为180rpm，可高效降解桔霉素，降解率可达98％，且...

【专利技术属性】
技术研发人员：张红印，张晓云，赵利娜，郑香峰，林珍，任晓锋，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32