一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂、制备及应用制造技术

一种以γ－亚麻酸为主要成分的生物制剂，其特征在于组成如下（重量百分比）：粗蛋白１８．５－２４．９；脂肪３０－３８；全糖３．５－４．０；纤维素１２．８－１６．３；可溶性非氮化物２４．０－３０．２；水分３．２－４．５；其主要有效成分稳定在：γ－亚麻酸２．４－５．３；多糖２．５－３．５；维生素０．０２５－０．０３０；氨基酸６．２０－８．１５；ＳＯＤ酶８００－９２０ｕ／ｇ。本发明专利技术具有原材料广泛易得，工艺流程简单，成本低廉，适于大规模生产等优点。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物工程技术，特别提供了一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂，生产该制剂的菌种及生产该制剂的方法。γ-亚麻酸(γ-Linolenic acid，简称GLA)作为人体必需脂肪酸，在机体内具有重要的生理功能。GLA为一种18碳三烯酸，分子式为C1830O2系无色或淡黄色油状液体。GLA是合成具有高度生理活性的前列腺素的前体，是组成人体各组织生物膜的结构材料，存在于人体多种组织中，在人体营养学和医疗方面具有重要作用。当人体摄取了过量的饱和脂肪酸或出现其他代谢紊乱时，正常脂肪酸代谢受阻，造成体内前列腺索缺乏，导致各种疾病产生。此时若及时补充GLA，便可保证体内前列腺素的正常代谢从而消除疾病，因此作为营养物质的GLA对于生命来说是极其重要的。此外，近年来大量的药理和临床研究表明，GLA具有重要的生理功能，如具有明显的降血脂作用；抑制血小板聚集和血栓素A2的合成；具有明显的抗脂质过氧化作用，具有抑制溃疡及胃出血作用；增强胰岛素作用等。随着研究的深入GLA对癌症、酒精中毒、炎症、减肥等均具有一定的疗效和改善作用。总之机体中若缺乏GLA，则会导致多种疾病的发生，由此预示GLA具有广泛的医疗保健前景。国际上开发GLA的应用研究，始于70年代月见草油的临床应用。但由于资源、环境等因素的影响，月见草籽资源受到限制，应用微生物发酵法生产GLA及其应用开发技术是国际上研究的新领域。1985年日本工业技术院化学研究所首先利用Mortierella(被孢霉)发酵法制取GLA获得成功，后由日本出光石油化学公司实现工业化生产，随后英国Sturge公司利用Mucor(毛霉)发酵法生产GLA也获得成功，由于菌体发酵产物中其它有效成份较少，上述两家公司皆以提取菌体中纯GLA为目的，工艺复杂，以其为原料开发的产品，仅具有GLA单一成分的功能。中国专利91106190.8公开了一种用已知的剌孢小克银汉霉制备γ-亚麻酸为主的生物制剂的方法，用其生产出的生物制剂，γ-亚麻酸含量可达到油脂中8-15％，还含有多种有效成份，如氨基酸，多糖超氧化物岐化酶(SOD)和维生素等，但是除γ-亚麻酸外其他有效成份很不稳定。并且所公开的方法尚处于实验室阶段，通过简单放大不能达到工业生产的目的。另外，所用菌种产率较低，菌体干重在25-27克/升，最终产品成本较高。本专利技术的目的在于提供一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂及其制备方法，可以实现工业化生产，并且其产品有效成份含量稳定，工艺简单，成本较低。本专利技术提供了一种以γ-亚麻酸为主要成份的生物制剂，其特征在于组成如下(重量百分比)粗蛋白 脂肪 全糖纤维素18.5-24.9 30-38 3.5-4.0 12.8-16.3可溶性非氮化物 水分24.0-30.2 3.2-4.5其主要有效成分稳定在γ-亚麻酸 多糖 维生素 氨基酸2.4-5.3 2.5-3.5 0.025-0.030 6.20-8.15SOD酶800-920u/g上述生物制剂是本专利技术所提供菌种的代谢产物，本专利技术所提供菌种为剌孢小克银汉霉Cunninghamella echinulata(Thaxter)，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNO.0232，是以中国科学院微生物研究所，菌保库菌种AS3.154为原始菌种，分离其单孢子用微波处理，再将获得的新培养物的原生质球经紫外线诱变，摇瓶发酵筛选获得的新变异菌株。该菌株在葡萄糖土豆培养基上，菌落生长速度较快，25-35℃培养2-3天，直径可达2-3cm，初期为白色棉毛状，逐淅变灰黄色或驼黄色。菌丝体发达多分枝，幼令无横隔，直径15-20微米。分生孢子梗直立，分枝顶端膨大的汽囊表面着生小梗，小梗上形成园型或椭园型具有纤细刺的分生孢子，直径10-15微米。该变异株较始发菌株菌丝体松散，生长速度快，形成孢子量多。并且经发酵后菌粉产量高，可达28-32克/升，其他有效成分稳定。本专利技术所提供的生物制备工艺流程如下保存菌株→生产菌株→菌种扩大→种子罐→发酵罐→过滤→冲洗→脱水→干燥→检验。菌种培养由冻干管或沙土管保存菌株移接至土豆汁琼脂斜面上，于25-35℃培养5天，进行菌种活化，再将活化的斜面菌种移接至茄形瓶中进行扩大培养。种液培养将斜面菌种制成孢子悬浮液，接种于种子罐中进行培养，种子培养基为葡萄糖或蔗糖2-4％，尿素0.1-0.5％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％，VB10.0015％，PH5.5-6.5。种子罐培养温度25-35℃；风量1∶0.1-1∶0.5V/V，罐压0.04-0.06MPa；搅拌速度120-180rPm；培养时间24-40小时。发酵培养将生长良好的种子液接入发酵罐中培养，发酵培养基为葡萄糖或蔗糖4-10％，KH2PO40.01-0.05％，MgSO40.01-0.03％ CaCO30.01％ VB10.0015％，PH为5.5-6.5；接种量5-10％，培养条件同种子罐，培养时间4-5天；菌体收集培养结束后，用三足式离心机离心收集菌体，经水洗脱水后，用振动式干燥机进行菌体干燥，使其含水量达到3.2-4.5％，经检验合格后，冷芷备用。毒理学、药理学及临床疗效结果急性毒性实验结果表明，本专利技术100g/kg经口给与小鼠，未见明显毒性，本专利技术的最大耐受量＞100g/Kg(含GLA3.33g)相当于临床用量的666倍。长期毒性实验结果表明，本专利技术按10g/Kg/日给大鼠灌服，7.5g/Kg/日经口投于狗，连续饲服6个月，未见动物出现外观、体重、血象、血液生化学指标及脏器组织的毒性变化。致畸敏感期毒性试验表明，本专利技术口服50mg/Kg和150mg/Kg(含GLA量)于胚鼠器官形成期连续给药10天，无论是大剂量还是小剂量，对胎鼠的体重、身长、尾长、死胎、吸收胎、存活胎、窝重与对照组比较，无明显差异，胎鼠在外观、内脏、骨骼检查均未见畸形，表明本品对小鼠的胚胎发育无影响。致突变作用结果表明，通过Ames试验，染色体畸变试验、微核试验的检测证明本专利技术的至突变作用为阴性。药效学试验本专利技术27mg/kg(以GLA量计，下同)经口给予大鼠，11.5mg/Kg经口给予家兔，对高脂饲料喂养所致的脂代谢紊乱有预防保护作用，其降低甘油三脂作用明显强于32mg/Kg月见草油。本专利技术11.5mg/Kg治疗给药对实验性高脂血症家兔有降低胆固醇和甘油三酯，升高高密度脂蛋白作用，其降低胆固醇作用明显强于月见草油。本专利技术11.5mg/Kg经口给予家兔，可抑制高脂饲料所至的TC、TG升高，防止HDL下降，降低肝脏脂质沉着，降低肝系数，减轻兔主动脉粥样硬化斑块的程度，其中肝脏TG含量明显低于月见草油组(P＜0.05)，主动泳粥样硬化斑块抑制率明显高于月见草油。临床疗效观察结果以本专利技术为主要原料制成的调脂抗栓丸，其初步临床疗效观察表明，对血液流变性，改善血液粘稠度(血浆粘度，全血粘度，红细胞变形性等)具有明显的治疗作用。具有明显调节脂蛋白作用，对降低总胆固醇、甘油三酯有显著作用，对提高抗动脉硬化因子的高密度脂蛋日—胆固醇及其亚组分都有明显的效果。另外对症候的改善如目眩、头痛、无力、头晕、等都有很好的作用。本专利技术生物制剂的特点是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以γ－亚麻酸为主要成份的生物制剂，其特征在于组成如下（重量百分比）粗蛋白 脂肪 全糖 纤维素１８．５－２４．９ ３０－３８ ３．５－４．０ １２．８－１６．３可溶性非氮化物 水分２４．０－３０．２ ３．２－４．５其主 要有效成分稳定在γ－亚麻酸 多糖 维生素 氨基酸２．４－５．３ ２．５－３．５ ０．０２５－０．０３０ ６．２０－８．１５ＳＯＤ酶８００－９２０ｕ／ｇ。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵振英，周连甲，马清禄，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：21[中国|辽宁]