IgG Fab-BPI融合蛋白质及其DNA序列制造技术

本发明专利技术公开了ＩｇＧ　　Ｆａｂ—ＢＰＩ融合蛋白质，是由抗体ＩｇＧ１与杀菌／通透性蛋白质ＢＰＩ融合而成，在它的氨基（Ｎ）端有ＩｇＧ＃－［１］的重链和轻链；在它的羧基（Ｃ）端有ＢＰＩ蛋白质或ＢＰＩ生物活性片段，其中ＩｇＧ１是广谱抗内毒素ＬＰＳ单克隆抗体（ｍＡｂ），它们融合表达于真核细胞，所得融合蛋白表达产物具有广谱、强大的中和内毒素和杀菌作用，可用于人体革兰氏阴性菌感染性疾病的治疗。本发明专利技术还公开了该融合蛋白质的ＤＮＡ序列。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于用在抗人体细菌感染的融合蛋白质，即IgG Fab-BPI融合蛋白质，及编码这种融合蛋白质的DNA序列。抗体LPS mAb一般都具有一定的中和LPS作用(Zigler，J infect Disl988；158(2)286-290)，但是，由于细菌LPS的种属差异和内源异质性，多数mAb只能中和免疫用LPS和/或与其相近种属细菌的LPS，而且少有保护作用(Mine，Km，Infect Immun 1996；52(1)56-62；Mutharia LM，Ingect Immun1984；45631-636；Brade L，Infect Immun 1987；55462-486)。对于本专利技术特别有意义的报道之一是用LPS-HDL(脂多糖-高密度脂蛋白)复合物鉴定多株抗LPS mAb的交叉反应性(Heumann D，J Infect Dis.1991；163762-768)，该研究表明大多数抗LPS mAb缺乏与之的交叉反应性，经调查研究发现，LPS-HDL是不同细菌LPS在人体内代谢的共同产物，纯化的LPS约90％形成LPS-HDL复合物，细菌外膜碎片中50％以上的LPS形成LPS-HDL复合物，完整的细菌外膜和完整的细菌则分别有20％和10％的LPS形成LPS-HDL(焦炳华，《分子内毒素学》，上海科学技术文献出版社1995)。而LPS-HDL依然有完整的LPS致休克和DIC的生物学活性，可见LPS-HDL是内毒素致病的关键因素之一。目前未发现用LPS-HDL制备内毒素抗体的研究。杀菌/通透性增强蛋白(BPI)是人多形核粒细胞嗜天青颗粒中的一种阳离子蛋白质，具有与细菌LPS结合从而增强革兰氏阴性菌通透性的作用，是十分有效的内源性杀菌物质(Ooi J Biol Chem 1987；26214891-94)。BPI结合LPS也具有中和游离LPS的作用(Weiss，Blood 1987；69(2)652-659)。BPI结合LPS的部位在其N-端，精确地说是在第65-99位氨基酸。但其与LPS的结合能力是有限的，即对粗糙型LPS有较好的结合作用，对光滑型的LPS的结合能力则随着LPS特异性多糖链的加长而降低(Elasbach P et al.Basic Principlesand clinical corelates.1992；2603-636)。BPI N端因表达产物的分子量约25Kba，半衰期短，需粘附于大分子物质才能较好地发挥作用(Dahlberg PS，et al.J Surg Ras 1996，63(1)44-48)。与BPI具有高度同源性的LPS结合人体内存在的蛋白(LBP)是一种可溶性的血液内成分，但其作用是加强LPS的解聚，增强其毒性(Marra M etal.Gritical care Medicine，1994；22(4)553-564)。从而致使BPI在应用中出现以下情况LPS攻击小鼠同时注入BPL，保护效率达90-95％；LPS攻击小鼠1小时后注入BPI，保护效率仅50％，2小时后注入，则为0。可见将BPI用于临床实践，尚需克服LBP对BPI的竞争抑制作用，单纯应用BPI不能很好抑制体内毒素对人体侵害。对于本专利技术特别有意义的报道之二是重组合成包括抗肿瘤IgG抗原结合部分为融合的第一成分，和以白细胞介素(粘附分子)为第二融合成分的杂交融合蛋白质。Fell HP et al.J Lmmun 1991；146(7)2446-2452中叙述了IL-2/IgG融合蛋白的合成，其主要目的是以IgG Fab段结合于抗原成份，通过IL-2吸引粘附于单核巨噬细胞，增强单核巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬和杀伤。对于本专利技术有特别意义的报道之三，是重组合成包含BPI结合LPS为第一融合成份，和以IgG Fc段为第二融合成分的杂交融合蛋白(专利号NO93109046；Dahberg PS，et al.Arch Surg；1996；1311173-1177).首先其选用IgG的成份为恒定区，目的是增强单核巨噬细胞等对BPI结合LPS抗原的吞噬作用而不是起中和LPS抗原作用；其次，该IgG虽是一种mAb，其制备不是用LPS-HDL筛选出。所以，其融合蛋白质表达产物不具有广谱、强的中和内毒素和杀菌作用。本专利技术的目的是提供一种IgG Fab-BPI融合蛋白质及其DNA序列，它是在制备了广谱抗内毒素(LPS)的单克隆抗体(mAb)的基础上，将该抗体(免疫球蛋白IgG1)的Fab段(VH、Chl、VL、CkHinge)基因与白细胞中分离得到的杀菌通透性增强蛋白(BPI)N端1-629，或205-225位的基因融合，表达于真核细胞，所得融合蛋白表达产物具有广谱、强大的中和内毒素和杀菌作用，可用于人体革兰氏阴性菌感染疾病的治疗。本目的以下列技术方案来实现该IgG Fab-BPI融合蛋白质，是由抗体IgG1与增强蛋白BPI(N)端的基因融合而成，在其氨基(N)端有抗体IgG1的重链和轻链；在其羧基(C)端有BPI蛋白质或BPI蛋白质生物学活性片段，所述的抗体IgG1是一种广谱抗内毒素LPS的单克隆抗体(mAb)。其中所述的抗体IgG1的重链包括有重链可变区和重链恒定区；抗体IgG1的轻链包括有轻链可变区和轻链恒定区。IgG1的重链恒定区是CH1；轻链恒定区是CK。其中所述融合的BPI N端基因主要指1～629，或205～225位。在BPI蛋白质与IgC1之间还包括有IgG1的绞链区和一个15个氨基酸的连接片段。所述BPI蛋白质是由208个氨基酸或55个氨基酸组成。IgG Fab-BPI融合蛋白质的DNA序列，该DNA序列包括抗体IgG1的重链序列和轻链序列；DNA序列还包括有蛋白质BPI的1～208个氨基酸残基的编码序列和BPI的68～122个氨基酸残基的编码序列。IgG Fab-BPI融合蛋白是两种抗LPS物质的组合，相互弥补了各自的缺点，而有益于各自抗LPS作用优点的充分发挥。显而易见，本专利技术的IgG1选择的是Fab段，目的是增加融合蛋白对各种革兰氏阳性菌LPS的中和，所以具有广谱的抗LPS的作用，弥补了BPI的交叉反应局限性，且提高了融合蛋白对LBP的竞争抑制作用，延长了半衰期BPI则由于其强大的中和LPS作用，而提高了融合蛋白的抗LPS和杀菌能力。总的来说，该融合蛋白将不受发病时间、条件的限制，成为能广泛应用的有积极效果的抗革兰氏阴性菌感染的新型药物。本专利技术在按照该融合蛋白质的组成结构在制备过程编码了这种蛋白质的DNA序列，即IgG的重链序列、轻链序列、蛋白质BPI 1-208氨基酸序列、BPI55个氨基酸序列。本专利技术所得的抗LPS mAb属免疫球蛋白IgG1型，Fab段(VH、CH1、VL、Cr)包含完整抗体的抗原结合部位和部分恒定区，是具有良好的抗原结合能力的小分子抗体，一方面具有较长的半衰期，且易于穿过胎盘，另一方面不易由于鼠源性而致使人体对其产生免疫排斥。IgG1是用LPS-HDL筛选出的广谱抗LPS免疫球蛋白，在实验方案中选择包含VH、CH1、V1、CK、Hinge基因，以及自行合成的16个氨基酸的Linker基因，作为融合蛋白的第一融合成份。杀菌、通透性增强蛋白(BPI)是人多形核粒细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＩｇＧ Ｆａｂ－ＢＰＩ融合蛋白质，其特征它是由抗体ＩｇＧ１与杀菌／通透性增强蛋白ＢＰＩ（Ｎ）端的基因融合而成，在其氨基（Ｎ）端有抗体ＩｇＧ１的重链和轻链；在其羧基（Ｃ）端有ＢＰＩ蛋白质或ＢＰＩ蛋白质生物学活性片段，所述的抗体ＩｇＧ１是一种广谱抗内毒素ＬＰＳ的单克隆抗体（ｍＡｂ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：马越云，于文彬，丁振若，苏明权，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：87[中国|西安]