一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用制造技术

本发明专利技术涉及一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用，纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成，第一探针的表达式为MNP@X‑DNA1，其中MNP为磁性纳米颗粒内核，X为包覆在磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层，DNA1为修饰在亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤DNA的第一部分互补的第一互补核酸链，第二探针的表达式为Rep‑DNA2，其中Rep为能用ICP‑MS检测的报告元素形成的报告元素内核，DNA2为修饰在报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤DNA的第二部分互补的第二互补核酸链。本发明专利技术的双纳米探针MNP@X‑DNA1与Rep‑DNA2的制备简单、可控、易重复。

Application of a nano particle coupling probe system in high sensitivity detection of ctDNA

The present invention relates to a nano particle coupling probe system in the application of ctDNA high sensitive detection of the nanoparticle probe coupling material system by the first and second probes. The expression of the first probe for MNP@X DNA1, where MNP is the kernel of magnetic nanoparticles, X magnetic nanoparticles coated on the hydrophilic shell core, DNA1 for the modification in the hydrophilic shell and capable of circulating tumor target DNA the first part of the first complementary complementary nucleic acid chain, expression of the second probe for Rep DNA2, which Rep can be used to detect ICP report report element element MS as the kernel, DNA2 is modified in the report on the second part of the kernel elements the complementary second complementary nucleic acid chain and circulating tumor DNA. The invention of the double probe MNP@X DNA1 and Rep nano DNA2 preparation is simple and controllable, easy to repeat.

【技术实现步骤摘要】
一种纳米颗粒耦合探针体系在ctDNA高灵敏检测中的应用
本专利技术属于医用生物纳米材料
，具体涉及一种ctDNA检测用纳米颗粒耦合探针材料及其制备方法和应用。
技术介绍
肿瘤产生的第一步是基因突变，癌症归根结底是一种基因病。随着癌症研究的不断深入，人们在癌症患者的外周血中检测到与肿瘤细胞一致的突变基因，即循环肿瘤DNA(circulatingtumorDNA，ctDNA)。ctDNA是由肿瘤细胞释放到血液循环系统中的基因碎片，是癌症散落在血液中的“信息密码”。癌症的分期直接与血液中的ctDNA浓度相关，中晚期患者ctDNA浓度显著高于早期或者超早期患者。ctDNA浓度随肿瘤发生发展而升高，因肿瘤得到控制而降低，是一类高敏感性、高特异性的肿瘤血液标记物。ctDNA浓度的变化要远早于影像学等手段检测到肿瘤组织的变化。与传统的影像学诊断、内窥镜检查以及病理学诊断相比，对ctDNA的精准分析能实时监测病人体内肿瘤负荷的动态信息，可更加敏感地发现疾病的变化，更加科学、迅速的评价某一治疗方案的效果，优势显著。最为重要的是，对ctDNA的监测只需要抽取患者少量外周血，对患者没有副作用，可实现多次实时高频监测。因此，ctDNA的检测及其生物学指标的研究将有可能为临床肿瘤的早期诊断、预后判断及跟踪随访提供一系列方便、快捷、特异、无创的检测手段。ctDNA检测是一种新型无创的“液体活检”方式，有望弥补现有临床诊断方法的不足，提供从肿瘤细胞水平到分子水平的分析平台，为个体化治疗提供参考。基于ctDNA检测的无创的“液体活检”技术有望取代侵入性的“组织活检”用于肿瘤治疗进展的监测，该领域的基础研究具有非常重要的科学意义和临床价值。ctDNA检测是肿瘤早期筛查的绝佳方式，但是在肿瘤发生的早期、超早期甚至细胞阶段，血液中的ctDNA浓度极低(10～180ng.ml-1)，如何检测出早期癌症患者血液中极低含量的ctDNA是首要技术难点。这对检测方法的灵敏度提出了很高的要求。另外，病人的血清成分异常复杂，ctDNA只占血液系统中总核酸中的0.01％-1％，因此要实现ctDNA的高灵敏度检测，另一技术难点就是如何避免严重的背景基因干扰。近年来，越来越多的学者致力于ctDNA检测的研究。已经报道的检测方法主要是基于两个思路，一是通过聚合酶链式反应(PCR)大幅度扩增ctDNA，使之达到可以检出的浓度。包括数字PCR和BEAMing技术。数字PCR可用于评估和检测血浆中的ctDNA的特异性突变，可用于绝对定量，灵敏度可达单个核酸分子，检测限低至0.001％。BEAMing技术结合数字PCR与流式技术来确定突变情况，灵敏度达到0.005％。另一个现有的检测思路是直接进行全基因组测序或者PCR扩增后再进行测序，包括标记扩增深度测序(TAM-Seq),癌症个体化深度测序(CAPP-Seq),全基因组测序，全外显子测序等。TAM-Seq是先利用特异性引物进行循环的目标区域扩增，再利用不同特性的接头标签进行二次扩增，然后进行双向重复测序。CAPP-Seq利用定制化的突变位点库作为“筛选器”，对样本进行靶向捕获后再进行超深度测序，检测灵敏度高，特异性强。目前国际上对癌症早期ctDNA检测的研究正处于起步阶段，基于PCR扩增的检测方法存在的问题是测试结果很大程度上依赖于基因扩增，假阳性几率高，预处理繁琐，依赖于活检提供的基因突变信息，检测设备和试剂完全依赖进口。基于基因测序的检测方法尽管报错率低，但是研发和测试的成本都非常高，检测周期长达一周以上，很难广泛应用于临床检测。总体而言，已有的检测方法因为灵敏度、检测限、检测价格和检测周期等限制还未能在临床医学中大范围推广。大胆探索、努力开发方便、快捷、特异、灵敏的ctDNA检测方法一直是研究人员追求的目标。近年来，纳米诊疗医学的建立和发展为癌症等重大医学疾病的早期诊断和原位治疗提供了一个全新的多功能诊治平台，有望大幅度提高癌症早期诊治的效率。纳米材料具有合成可控，形貌结构、表面特征易调控等特点，基于纳米材料的生物传感器借助纳米材料独特的物理、化学等性质能够极大提高生物分子的检测灵敏度，具有选择性高、分析速度快、操作简易和仪器价格低廉等特点，是纳米生物医学研究的一个重要分支，逐步成为生物医学研究领域的一个热点。综上所述，发展基于纳米生物技术的ctDNA纳米检测新策略，研究一种方便、快捷、特异、无创的ctDNA纳米检测方法，推进液体活检在肿瘤诊疗领域中的应用，具有重要意义和价值。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种可高灵敏度、特异性识别ctDNA的纳米颗粒耦合探针材料体系，以及使用该体系的检测方法。在此，一方面，本专利技术提供一种纳米颗粒耦合探针材料体系，所述纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成，所述第一探针的表达式为MNP@X-DNA1，其中MNP为磁性纳米颗粒内核，X为包覆在所述磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层，DNA1为修饰在所述亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤DNA的第一部分互补的第一互补核酸链，所述第二探针的表达式为Rep-DNA2，其中Rep为能用ICP-MS检测的报告元素形成的报告元素内核，DNA2为修饰在所述报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤DNA的第二部分互补的第二互补核酸链。其中，DNA1为目标ctDNA的一部分的互补链(例如ctDNA互补链的一半碱基)，DNA2为目标ctDNA另一部分的互补链(例如ctDNA互补链另一半碱基)。后述检测过程中，目标ctDNA能够将DNA1和DNA2连接起来从而将两种纳米颗粒桥连起来。较佳地，所述MNP由顺磁性纳米颗粒形成，优选由Fe3O4和/或非晶态铁形成。较佳地，所述Rep由能用ICP-MS灵敏地检测出的重金属元素形成，优选由Au、Ag、Pt中的至少一种形成，ICP-MS检测下限低至0.01ppb。较佳地，所述第一探针通过将磁性纳米颗粒表面包覆亲水性壳层后进行氨基修饰，并与DNA1发生缩合反应得到。在一个示例中，可以通过制备粒径30-50nm的磁性纳米颗粒，表面包覆亲水性壳层(例如SiO2)进行亲水改性，得到MNP@X(例如MNP@SiO2)，对MNP@X进行氨基修饰，并利用氨基与捕捉DNA1上修饰的羧基发生缩合反应，将捕捉DNA1成功修饰在MNP@X表面，制备MNP@X-DNA1。较佳地，所述X为SiO2和/或亲水性有机物。X为SiO2的情况下，第一探针可以表示为MNP@SiO2-DNA1。较佳地，所述第二探针是通过将DNA2(含有多个碱基A的DNA2)和Rep纳米颗粒(例如金纳米颗粒)稳定分散在水溶液中得到。在一个示例中，根据腺嘌呤脱氧核糖核苷酸(A)对金纳米粒子表现出强的亲和力，能够有效地稳定金纳米颗粒，利用金纳米粒子与腺嘌呤碱基的特殊亲和作用将连接有多个腺嘌呤的引物DNA2修饰于金纳米粒子表面制备探针Rep-DNA2。另一方面，本专利技术还提供一种使用上述纳米颗粒耦合探针材料体系的使用方法，包括：用游离DNA提取试剂盒提取出待测血清中的DNA，分散在无氧水中，加热使双链DNA解链为单链DNA；加入所述第一探针和第二探针；通过磁性分离得到磁性纳米颗粒表面有报告元素的纳米颗粒和/或磁性纳米颗粒表面没有报告元素的纳米本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成，所述第一探针的表达式为MNP@X‑DNA1，其中MNP为磁性纳米颗粒内核，X为包覆在所述磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层，DNA1为修饰在所述亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤DNA的第一部分互补的第一互补核酸链，所述第二探针的表达式为Rep‑DNA2，其中Rep为能用ICP‑MS检测的报告元素形成的报告元素内核， DNA2为修饰在所述报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤DNA的第二部分互补的第二互补核酸链。

【技术特征摘要】
1.一种纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述纳米颗粒耦合探针材料体系由第一探针和第二探针组成，所述第一探针的表达式为MNP@X-DNA1，其中MNP为磁性纳米颗粒内核，X为包覆在所述磁性纳米颗粒内核的亲水性壳层，DNA1为修饰在所述亲水性壳层上的能够与目标循环肿瘤DNA的第一部分互补的第一互补核酸链，所述第二探针的表达式为Rep-DNA2，其中Rep为能用ICP-MS检测的报告元素形成的报告元素内核，DNA2为修饰在所述报告元素内核上的能够与目标循环肿瘤DNA的第二部分互补的第二互补核酸链。2.根据权利要求1所述的纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述MNP由顺磁性纳米颗粒形成，优选非晶态单质铁形成。3.根据权利要求1或2所述的纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述Rep由能用ICP-MS检测出的重金属元素形成，优选由Au、Ag、Pt中的至少一种形成。4.根据权利要求1至3中任一项所述的纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述第一探针通过将磁性纳米颗粒表面包覆亲水性壳层后进行氨基修饰，并与DNA1发生缩合反应得到。5.根据权利要求1至4中任一项所述的纳米颗粒耦合探针材料体系，其特征在于，所述X为SiO2和/或亲水性有机物。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：胡萍，施剑林，
申请(专利权)人：中国科学院上海硅酸盐研究所，
类型：发明
国别省市：上海,31