人源抗－HBsFab的制备方法技术

本发明专利技术涉及人源抗－ＨｂｓＦａｂ的制备方法。该方法采用分别克隆抗ＨＢｓ的Ｆｄ和轻链基因于ｐＢＡＤ中，再将ｐＢＡＤ－轻链复合体插入到已克隆有Ｆｄ的载体中，形成双启动子、双肽分别表达，菌体周质腔定向分泌自行组装的方式制备活性抗体片段。本发明专利技术表达系统较原ｐＣｏｍｂ３有明显优势，增菌、发酵阳性株获理想结果，Ｆａｂ的表达量及活性都有明显提高，已具备批量制备的条件。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体涉及人源抗-HBsFab的制备方法。本专利技术公开的人源抗HBsFab的制备方法采用分别克隆抗HBs的Fd和轻链基因于pBAD中，再将pBAD-轻链复合体插入到已克隆有Fd的载体中，形成双启动子、双肽分别表达，菌体周质腔定向分泌自行组装的方式制备活性抗体片段。具体制备步骤包括 1、选择商品化高表达载体pBAD/gIII作为本产品的克隆载体，以pComb3/anti-HBsFab菌株的质粒为模板，根据pBAD载体的要求与Fab基因结构分别设计下列引物Fd链Forward；5’-TG AAG CTGCTC AGA TCT GGG，Backward；5’-TTA CTA AGA TCT TTT GTCACA AGA TTT GG，λ轻链；Forward；5’-ATG GCC GAG CTC CAGCCT G，Backward；5’-TT AAC TCT AGA ACT ATG AAC。分别扩增Fd与λ轻链，电泳并胶回收目的片段。2、依据Fd与λ轻链两端所引入的特异性酶切位点，以相同的内切酶分别酶切载体，电泳并胶回收载体片段，分别以连接酶与相应的Fd与λ轻链片段连接，构建pBAHBs-Fd和pBAHBs-Lc单链抗体片段表达载体。3、连接产物转化Top10细菌后，经PCR法或酶切鉴定，筛选目的单链抗体片段基因阳性克隆，形成的pBAD启动单肽表达模式。4、设计特异引物，以基因扩增方式制备包含λ轻链抗体片段基因和启动子、引导序列的核苷酸序列。5、双酶切已克隆的含Fd抗体片段基因的载体和步骤4扩增制备的核苷酸序列，电泳并胶回收目的片段，以连接酶连接，改构后的重组质粒图见图7；6、载体转化Top10细菌后，经测序和酶切鉴定，筛选阳性克隆，增菌、发酵培养所选克隆，在阿拉伯糖诱导条件下表达融合蛋白，进行双启动表达试验，验证双肽同步表达的可行性。7、筛选阳性菌株进行人源抗体片段的批量制备。本专利技术所述的分泌性表达载体为pBAD/gIII，其结构见图6。本专利技术实施例1详细描述了人源抗-HBsFab的制备。经对本专利技术获得的抗HBsFab的测序，分别以5’-GTG CCG TTC TAT AGC CATAGC为正向测序引物，5’-ATT GTT ATT ACT CGC GGC CC为正向测序引物，委托上海博星基因芯片有限责任公司进行测序，测得Fd序列见序列1(Fd-DNA)，λV序列见序列2(λV-DNA)。经与BLAST(Basic local alignment search tool)比对显示，测序结果与预期结果完全一致，确认人源抗体基因的正确克隆。对本专利技术获得的抗体蛋白进行生物活性鉴定1.将制备的抗-HBs Fab 3μl直接点样于硝酸纤维素膜上，以BSA和非相关表达上清作阴性对照。待干后用5％脱脂奶粉封闭，室温2小时或4℃过夜，洗涤3次，加入1∶1000稀释得HRP标记得羊抗人IgG Fab，室温反应1小时，洗涤3次，加入DAB显色液，15分钟后，加入2M H2SO4终止反应，结果显示所挑取克隆的dot blot结果均为阳性，见附图说明图1，于箭头处可见抗-HBsFab与酶标抗体的特异性结合，而BSA与酶标抗体无显色反应，证明人源抗-HBsFab的正确组装。2.将制备的抗-HBsFab行15％SDS-PAGE电泳，电泳毕用半干转印法将分离的蛋白条带转移到硝酸纤维素膜上。用5％脱脂奶粉封闭，室温2小时或4℃过夜，洗涤3次，加入1∶1000稀释得HRP标记的羊抗人IgG Fab，室温反应1小时，洗涤3次，加入DAB显色液，15分钟后，加入2M H2SO4终止反应，Western blot结果见图3，于分子量约47.5kd处可见阳性条带，亦证明人源抗-HBsFab的正确组装。对本专利技术获得的抗-HBsFab的抗原结合活性进行研究1.以HBsAg作为配体，HBsAg(mg/ml)3μl抗-HBsFab点样于硝酸纤维素膜上，待干后用5％脱脂奶粉封闭，室温2小时或4℃过夜，洗涤3次，加入制备的抗-HBsFab，室温反应1小时，洗涤3次，加入1∶1000稀释得HRP标记的羊抗人IgG Fab，室温反应1小时，洗涤3次，加入DAB显色液，15分钟后，加入2M H2SO4终止反应，结果显示人源抗-HbsFab具有非常好的抗原结合能力，于箭头处呈阳性结果，见图4。2.根据某一抗原经免疫途径获得的动物抗体和杂交瘤技术制备的鼠单克隆抗体的亲和力均在一相对稳定的水平，其与对应的生物工程抗体的抗原结合反应有竞争抑制的原理，测定抗-HBsFab的抗原特异性亲和力。在硝酸纤维素膜上进行不同抗原浓度(3μg，0.3μg，0.03μg)、不同抗体抑制浓度(10倍、等倍、1/10倍于抗-HBsFab)的抗原-抗体反应，加入1∶1000稀释得HRP标记的羊抗人IgG Fab，室温反应1小时，洗涤3次，加入DAB显色液，15分钟后，加入2MH2SO4终止反应，观察结果。结果显示该系统制备的人源抗-HBsFab具有非常好的抗原结合活性，见图5。1)3组的Fab皆呈阳性，2)3组的3种阴性对照皆为阴性，3)抗-HBs Fab组对不同浓度的抗原皆为阳性且能显示浓度差，4)3种浓度梯度的鼠单克隆抗-HBsAg均未起到抑制作用，5)10倍浓度羊抗-HBsAg(lane 1)呈现一定的竞争抑制效应，表现为HBsAg点样斑点显色变淡。对本专利技术获得的抗体进行急性毒性研究随机选取Bal b/c鼠3只为一组，以纯化的抗-HBsFab 250μg/只与500μg/只进行腹腔内注射(按人体生物制剂0.05-0.5mg/m2折算出小鼠的用量，分别以50倍与100倍超高量使用)，次日重复一次。结果显示人源抗-HBsFab无急性毒性反应。人源生物工程抗体片段的突出优势是临床应用，所以高活性、高表达是关键所在，只有达到上述效果的表达系统才有实际价值。诸多研究表明用E.Coli.的周质腔定向多肽表达能够满足Fab的活性要求，双启动子表达、定向分泌亦能达到正确组装的目的，但迄今尚未有用作商品生产，进展到临床应用的资料，其中表达系统的优化，使之更实用、更经济，更适于批量生产是关键。本专利技术涉及的表达系统较原pComb3有明显优势，增菌、发酵阳性株获理想结果，菌体密度OD600达48.3，蛋白产量80mg/L，Fab的表达量及活性都有明显提高，经济性也大大优于pComb 3表达系统，已具备批量制备的条件。(2)pBAHBsFab克隆EcoR I和Xba I分别酶切切pBAHBs-Fd载体和pBAD/Lc扩增产物，胶回收酶切产物，以连接酶连接后转化感受态TOP10菌株，供双重插入筛选。4、阳性菌株的筛选与鉴定筛选双重插入菌落，阿拉伯糖诱导表达，PAGE和Western blot鉴定抗-HBsFab的表达效果。克隆载体的酶切鉴定取转化菌落，LB增菌过夜，常规法制备质粒DNA.1.Not I单酶切双重插入的载体，以同样酶切无插入pBAD载体为对照，琼脂糖电泳分别于5.7Kb和4.1Kb处可见酶切条带，证实Fd和pBAD/Lc基因的正确插入；2.Xho I与Xba I双酶切，用Marker显示分别于1.6Kb和4.1Kb处可见酶切条带。见图2。(2)阳性克隆的诱导本文档来自技高网...

【技术保护点】
人源抗－ＨｂｓＦａｂ的制备方法，其特征在于该方法采用分别克隆抗ＨＢｓ的Ｆｄ和轻链基因于ｐＢＡＤ中，再将ｐＢＡＤ－轻链复合体插入到已克隆有Ｆｄ的载体中，形成双启动子、双肽分别表达，菌体周质腔定向分泌自行组装的方式。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩焕兴，陆慧琦，
申请(专利权)人：韩焕兴，罗荣城，陆慧琦，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]