本发明专利技术公开了一种蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL related homeobox11(MtWOX11)，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了所述基因在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。通过对遗传转化的方法获得的转基因株系分析证明，过表达该基因可显著提高豆科植物的种子的脂肪酸含量。预示本发明专利技术所述的基因具有广泛的应用前景，其实施将会用于豆类品质改良或创造新型豆科经济作物，对我国豆类经济作物生产具有重大意义。
MtWOX11 gene of alfalfa and its application in improving the content of fatty acids in seeds
The present invention discloses a kind of Medicago truncatula WOX gene family Mt WUSCHEL related homeobox11 (MtWOX11), the nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID No.1. The invention also discloses the application of the gene in improving the fatty acid content of the seed of the leguminous plant. The analysis of transgenic lines obtained by genetic transformation showed that overexpression of the gene could significantly increase the content of fatty acids in the seeds of leguminous plants. It indicates that the gene described in this invention has wide application prospects. Its application will be used for improving legume quality or creating new leguminous cash crops, which is of great significance for the production of bean economic crops in China.
【技术实现步骤摘要】
蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其在提高种子脂肪酸含量中的应用
本专利技术涉及WUSCHELrelatedhomeobox(WOX)家族基因及其应用，尤其涉及一种蒺藜苜蓿WOX家族基因MtWUSCHELrelatedhomeobox11(MtWOX11)及其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用，属于基因工程领域。
技术介绍
近年来，随着我国经济水平以及人民生活质量的提高，对大豆的需求也与日俱增。大豆是重要的豆科经济作物之一，其不仅能够提供高蛋白，更主要的是可以提供油分。然而目前我国的大豆品质不高，缺乏市场竞争力，需要大量进口大豆。因此培育高油高蛋白的大豆新品种已成为当前十分迫切的任务。目前，我国大豆产量和品质改良的研究工作主要集中在常规育种领域，而分子遗传改良还处于起步阶段。其原因主要在于：大豆为四倍体，基因组较大；大豆很难建立起遗传转化体系；大豆很难建立起突变体库，其构建过程比较复杂。因此发掘豆类模式植物并进行研究是解决这一问题的关键所在。蒺藜苜蓿作为豆科模式植物具有基因组小、自花授粉、遗传转化容易等特点，因此对蒺藜苜蓿种子发育机制进行研究不仅能让我们更好地了解豆科植物种子的发育，还能对提高我国大豆的产量和品质起到指导性的作用。WUSCHELrelatedhomeobox(WOX)家族基因是植物特有的一类转录因子。该家族基因在植物发育的关键时期起到很重要的调控作用，包括茎和根顶端干细胞的维持，胚胎发育基-顶轴极性模式的建立以及侧生器官的发育等(Schoofetal.,2000；vanderGraaffetal.,2009；Uedaetal.,2011)。WOX11基因是WOX家族中的一个成员。经检索，在拟南芥中，WOX11参与到再生根器官的发生。在水稻中，WOX11调控不定根的生长和发育。但检索发现，有关蒺藜苜蓿WOX家族基因MtWUSCHELrelatedhomeobox11(MtWOX11)核苷酸序列和氨基酸序列还未见报道，其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用也未见报道。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是一种蒺藜苜蓿WOX家族基因MtWUSCHELrelatedhomeobox11(MtWOX11)及其在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。本专利技术所述的蒺藜苜蓿WOX家族基因MtWUSCHELrelatedhomeobox11(MtWOX11)，其特征在于：所述基因命名为蒺藜苜蓿MtWOX11基因，该基因的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示。本专利技术所述蒺藜苜蓿MtWOX11基因在提高豆科植物种子脂肪酸含量中的应用。其中：所述豆科植物优选自苜蓿、蒺藜苜蓿、大豆、三叶草。利用本专利技术所述的蒺藜苜蓿MtWOX11基因构建植物过表达载体，进行植物转基因操作导入植物细胞，获得转基因植物。检测表明获得转基因植物的种子中脂肪酸含量得到显著提高。为了便于对转基因植物或细胞系进行筛选，可以对含有所述基因MtWOX11的植物表达载体(pEARLYGATE103-MtWOX11)进行加工，如可以加入选择标记(GUS等)或者具有抗性的抗生素标记物(潮霉素，卡那霉素，庆大霉素等)等。实际上，任何一种可以将外源基因导入植物中表达的载体都可以应用，本专利技术优选的载体是pEARLYGATE103。本专利技术利用公开的蒺藜苜蓿突变体库，分离筛选得到了蒺藜苜蓿MtWOX11基因的敲除突变体株系，通过分离研究蒺藜苜蓿MtWOX11基因的敲除突变体株系，利用SEQIDNo.2和SEQIDNo.3所示的引物序列，通过RT-PCR技术从蒺藜苜蓿中克隆到MtWOX11基因。检索显示：本专利技术首次克隆出蒺藜苜蓿MtWOX11基因及其编码的氨基酸序列，并且通过遗传转化的方法获得过表达MtWOX11的转基因植株。这是MtWOX11基因首次在蒺藜苜蓿中被克隆，并且在蒺藜苜蓿中过表达。转基因株系分析证明，过表达该基因可显著提高豆科植物的种子的脂肪酸含量(图4)。这证明，该基因参与了调控豆科植物苜蓿的种子的脂肪酸含量，对蒺藜苜蓿MtWOX11基因进行植物基因过表达遗传转化操作，可显著提高转基因植物种子的脂肪酸的含量。预示本专利技术所述的基因具有广泛的应用前景。其实施将会用于豆类品质改良或创造新型豆科经济作物，对我国豆类经济作物生产具有重大意义。附图说明图1：蒺藜苜蓿MtWOX11基因分析。其中WT为蒺藜苜蓿野生型植物作对照，mtwox11为突变体。A：图示蒺藜苜蓿MtWOX11的基因结构及突变体中Tnt1转座子的插入位置；B：蒺藜苜蓿MtWOX11基因的RT-PCR结果分析，Actin为基因内参做对照。分子生物学鉴定结果表明，Tnt1插入到MtWOX11基因的第二个外显子(图1A)，蒺藜苜蓿MtWOX11基因的编码区CDS为819bp，RT-PCR结果显示Tnt1的插入导致MtWOX11不能正常表达(图1B)。图2：蒺藜苜蓿MtWOX11基因编码的氨基酸序列比对。蒺藜苜蓿MtWOX11基因编码272个氨基酸的29.92kDa蛋白，具有典型的HOX超家族的“螺旋－环－螺旋－转角－螺旋(helix－loop－helix－turn－helix)”结构域(*号所示)。其中有蒺藜苜蓿中的MtWOX11、拟南芥中的AtWOX11、大豆中的GLYMA19G118400、水稻中的OsWOX11；MtWOX11与AtWOX11的氨基酸相似度为47％，MtWOX11与GLYMA19G118400的氨基酸相似度为60％，MtWOX11与OsWOX11的氨基酸相似度为47％。图3：蒺藜苜蓿MtWOX11基因的表达模式分析。qRT-PCR结果表明，MtWOX11基因虽然属于组成性表达，在各器官中均有表达，但在种子中的表达量最高，其次是在花、根、叶中的表达量较高，在茎、叶柄、顶芽中表达量较低。图4：过表达MtWOX11转基因植株种子的脂肪酸含量分析。灰色柱状图所示mtwox11突变体与野生型种子中脂肪酸含量的比值，黑色柱状图所示过表达MtWOX11转基因植株与野生型种子中脂肪酸含量的比值。*表示显著差异，AnovaSingleFactorp<0.05，**表示极显著差异，AnovaSingleFactorp<0.01。结果表明，过表达转基因植株种子中总脂肪酸含量与野生型相比增加了12.2168％，特别是C15.0(十五烷酸)、C15.1(顺-10-十五烯酸)、C16.0(棕榈酸)、C18.2N6C(亚油酸)、C20.2(顺-11，14-二十碳二烯酸)、C20.3N6(顺-8，11，14-二十碳三烯酸)、C20.4N6(花生四烯酸)、C20.5N3(顺式-5，8，11，14，17-二十碳五烯酸)、C24.0(二十四烷酸)等脂肪酸的含量在突变体中均有下降，而在过表达MtWOX11转基因株系中均有上升，其中，十五烷酸的含量显著提高。具体实施方式实施例1蒺藜苜蓿MtWOX11基因的克隆和表达分析1.1蒺藜苜蓿mtwox11突变体的获得和鉴定通过公开网站https://medicago-mutant.noble.org/mutant/database.php筛选了蒺藜苜蓿Tnt1标记的突变体库，并利用Thermalasymmetricinterlaced-P本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蒺藜苜蓿WOX家族基因Mt WUSCHEL related homeobox 11(MtWOX11)，其特征在于：所述基因命名为蒺藜苜蓿MtWOX11基因，该基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
【技术特征摘要】
1.一种蒺藜苜蓿WOX家族基因MtWUSCHELrelatedhomeobox11(MtWOX11)，其特征在于：所述基因命名为蒺藜苜蓿MtWOX11基因，该基因的核苷酸序列如SEQI...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩璐，周传恩，蒋洪娇，周欣，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：山东,37
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