乳蛋白的脱酰胺化方法和乳蛋白的变性方法技术

本发明专利技术提供一种在用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的酶将乳蛋白脱酰胺时，改善其脱酰胺化率和脱酰胺化速度的方法。另外还提供乳蛋白的酶变性方法。使具有直接作用于分子量５０００以上的蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺化而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的蛋白质脱酰胺酶作用于预先变性的乳蛋白，进行脱酰胺化。另外，使用该酶进行乳蛋白的变性。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用具有直接作用于蛋白质的酰氨基而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的脱酰胺作用的酶的乳蛋白的脱酰胺化方法和脱酰胺化乳蛋白的制造方法。另外，还涉及使用该酶的乳蛋白的变性方法和蛋白质分解物的制造方法。
技术介绍
一般来说，如果将蛋白质中的谷酰胺和天冬酰胺残基脱酰胺化产生羧基的话，该蛋白质的负电荷增加，结果等电点降低，水合力增加。而且造成由静电相斥力的上升带来的蛋白质间的相互作用的降低，即集合性的降低。由于这些变化，蛋白质的可溶性、水分散性大大增加。另外，蛋白质的负电荷的增加可以解开该蛋白质的折叠，改变高级结构，使埋在分子内部的疏水性区域露出到分子表面。因而，脱酰胺化蛋白质具有两亲的性质，成为理想的表面活性剂，蛋白质的乳化力、乳化稳定性、发泡性和泡沫稳定性大大提高。这样，蛋白质的脱酰胺化造成蛋白质的各种功能特性的提高，该蛋白质的用途飞跃性增加(例如Molecular Approaches to ImprovingFood Quality and Safety，D.Chatnagar and T.E.Cleveland，eds.，Van Nostrand Reinhold，New York，1992，p.37)。作为对蛋白质进行酶脱酰胺化的方法，已知在高pH(pH10)条件下的蛋白酶处理法(A.Kato，A.Tanaka，N.Matsudomi，and K.Kobayashi，J.Agric.Food Chem.，35，224，1987)、转谷氨酰胺酶法(M.Motoki，K.Seguro，A.Nio，and K.Takinami，Agric.Biol.Chem.，50，3025，1986)、肽谷氨酰胺酶法(UP 5082672A和J.S.Hamada，and W.E.Marshall，J.Food Sci.，54，598，1989)三个方法，但指出如下问题。在蛋白酶法中，不可避免作为其本来反应的肽键的断裂，由此，由脱酰胺化期待的蛋白质的功能性的提高受到阻碍(特别是泡沫稳定性降低)。另外，也造成苦味的生成。在转谷氨酰胺酶法中，为了抑制由作为其本来反应的谷氨酰胺和赖氨酸之间的异肽键的形成造成的交联反应，有必要预先化学保护赖氨酸残基的ε-氨基。因而，在用该方法生产食品用的脱酰胺化蛋白质的场合，在用可逆性保护基柠康酰基等保护后，将谷氨酰胺脱酰氨基，之后除去保护基，还必须进一步分离游离的柠康酸和脱酰胺化的蛋白质。这样，制造工序复杂，还有从成本方面来看，也是不优选的，离实用化还相当远。另一方面，在肽谷氨酰胺酶法中，由于该酶是专门催化本来低分子化的肽的脱酰胺化的酶，所以不能对原本状态的蛋白质产生作用(M.Kikuchi，H.Haya shida，E.Nakano，and K.Sakaguchi，Biochemistry，10卷，1222-1229，1971和B.P.Gill，A.J.OShaughnessey，P.Henderson and D.R.Headon，Ir.J.Food Sci.Technol.，9卷，33-41，1985)，需要使用蛋白质水解物(UP 5082672A和J.S.Hamada，and W.E.Marshall，J.Food Sci.，54，598，1989)。即不得已和蛋白酶合并使用，和上述蛋白酶法的场合一样，出现生成苦味肽、功能性、特别是泡沫稳定性降低这样的问题。作为解决这些问题的方法，公开了使用具有直接作用于蛋白质进行脱酰胺的作用的酶(蛋白质脱酰胺酶)的蛋白质脱酰胺化方法(特开2000-50887号公报)。另一方面，也已知通过热处理、变性剂的处理等使蛋白质变性的方法。使蛋白质变性的意义可以举出提高蛋白质分解酶敏感性、提高消化性或者提高乳化特性、泡沫特性、凝胶化特性等蛋白质的功能性等。在以往，一般用物理方法、化学方法进行蛋白质的变性。物理方法包括热处理、高压处理等。化学方法包括变性剂(脲、盐酸胍)、还原剂、氧化剂、酸处理、碱处理等。专利技术公开如上所述，作为蛋白质的脱酰胺化的方法，提出了4种方法。其中，使用具有直接作用于蛋白质进行脱酰胺化的作用的酶(蛋白质脱酰胺酶)的脱酰胺化法，由于不需要对蛋白质预先进行分解处理或者化学修饰，可以使用原本状态的蛋白质进行脱酰胺化，所以与其它3种方法相比较，可以说是优良的方法。但是，对该酶的作用进行研究，发现虽然可以作用于大部分蛋白质而进行脱酰胺化，但脱酰胺化速度和脱酰胺化率因蛋白质的种类而异，对于一部分蛋白质，不能得到充分的脱酰胺化效果。即，脱酰胺化速度和脱酰胺化率方面还有改善的余地。本专利技术的第1个方面是鉴于以上课题而提出的，其目的在于，在使用具有直接作用于蛋白质中的酰氨基进行脱酰胺，而没有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用的蛋白质的脱酰胺化方法中，改善脱酰胺化速度和脱酰胺化率。另一方面，如上所述，蛋白质的变性方法一般使用物理方法或者化学方法。在物理或化学变性方法中，随着蛋白质的分解、蛋白质侧链的破坏或者蛋白质的凝集·不溶化，在食品工业等产业中利用时，经常成为问题。因此，正在摸索使用酶的蛋白质变性方法。使用酶的方法与物理·化学方法相比较，反应的选择性高，且可以在温和的条件下进行，所以没有不希望的副反应，再者，由于可以减少能量消耗等理由，因此可以说优于物理·化学方法。特别是，可以在温和的条件下进行的酶的变性方法可以期待没有不理想的副反应、过分的变性的优点，或者由于发挥乳化特性、泡沫特性等功能性而成为比较合适的变性状态，因此，在工业上具有非常大的利用价值。但是，目前还不知道适当的酶变性方法。本专利技术的第2个方面是鉴于以上课题而提出的，其目的在于提供使用酶的蛋白质变性方法。本专利技术人鉴于上述本专利技术的第1个方面的课题，进行了各种研究。首先，在使上述蛋白质脱酰胺酶直接产生作用的场合，把不能得到充分的脱酰胺化效果的蛋白质α-乳球蛋白作为对象，尝试提高脱酰胺化速度和脱酰胺化率。结果发现，脱酰胺化时，通过使用预先进行了变性处理的α-乳球蛋白，可以显著提高脱酰胺化速度和最终的脱酰胺化率。本专利技术的第1个方面是基于这种发现，其构成如下。即，一种蛋白质(乳蛋白等)的脱酰胺化方法，其特征在于，使酶作用于变性蛋白质(变性乳蛋白等)，该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。另外，本专利技术人对用蛋白质脱酰胺酶进行脱酰胺化得到的蛋白质的性状进行了研究。而且，用分光光学手段分析的结果发现脱酰胺化的蛋白质3级结构被显著破坏，即发生了变性。另外还发现对于该脱酰胺化的蛋白质，与3级结构被破坏相对，2级结构得以保持。已知这样的变性状态对于发挥乳化特性、泡沫特性等功能性是比较好的结构(D.Panyam and A.Kilala，Trends in Food Sci.Tech.，Vol.7，120-125，1996)。而且发现脱酰胺化的蛋白质在对于蛋白质分解酶的敏感性方面显著得到改善。本专利技术的第2个方面是基于以上发现完成的，如下构成。即，一种蛋白质(乳蛋白等)的变性方法，其特征在于，使酶作用于蛋白质(乳蛋白等)，该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。附图说明图1是表示实施例2的用变性状态和未变性状态的α-乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乳蛋白的脱酰胺化方法，其特征在于，使酶作用于变性乳蛋白，其中该酶具有直接作用于蛋白质的酰氨基进行脱酰胺化而不伴有肽键的断裂和蛋白质的交联的作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：松村康生，森友彦，
申请(专利权)人：天野酶株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]