本发明专利技术提供一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用，该突变体包括A146位点是一个全新的突变位点，包括A146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。本发明专利技术突变体，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI‑1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。可以应用于制备治疗血栓性疾病的药物，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓等疾病。
A tissue type plasminogen activator mutant and its application
The invention provides a tissue type plasminogen activator mutant and its application. The mutant includes A146 loci, which is a completely new mutation site, including the substitution, deletion or addition of at least one or more amino acid residues, including A146. The present invention has significant resistance mutants, by its endogenous inhibitor (PAI 1) inhibition ability and enhanced the ability of plasminogen activator. It can be used in the preparation of drugs for the treatment of thrombotic diseases, including acute myocardial infarction, acute pulmonary embolism, stroke, and venous thrombosis.
【技术实现步骤摘要】
一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用。
技术介绍
随着社会和经济的迅速发展，人民生活质量的日益提高。其中，高糖、高蛋白和高脂肪食物在人们日常营养摄入中所占比例越来越高，从而导致高血压、高血脂、冠心病、心肌梗塞、脑梗塞等疾病形成，对整个人类的健康造成了巨大威胁。目前，心血管疾病，已经成为威胁人类健康的第一大杀手，尤其是血栓栓塞性疾病。其主要包括三类：(1)冠状动脉形成血栓，主要指急性心肌梗死(AMI);(2)脑血管形成血栓，即急性缺血性卒中；(3)静脉形成血栓，例如急性肺栓塞。根据统计，在美国每年大约有900,000人患有AMI，其中死亡人数多达225，000人，由于发病到死亡的时间特别快，其中大约有125，000人在未得到及时治疗便已经死亡。在我国，据统计每年有300万人需要溶栓药物治疗。而且，大多数的急性心肌梗死是由冠状动脉的闭合栓塞引起血流不足及心肌死亡而导致的。溶栓治疗是血栓性疾病治疗的重要手段，溶栓药物是通过溶解血栓、增加心肌血流、改善供氧使梗死范围缩小、改善缺血区的脑神经细胞损伤，从而使的临床治疗得到很大幅度的提高。国际多个大型临床实验证实，溶栓治疗可以降低AMI病死率30%以上。组织型纤溶酶原激活剂(tissueplasminogenactivitor，tPA)是血液中纤溶系统的生理性激活剂。由于tPA与血栓基质纤维蛋白具有较强的特异性亲和力，能在血栓局部有效的激活纤溶酶原为纤溶酶而使血栓溶解。tPA与链激酶、尿激酶等溶栓剂比较具有作用快、不造成全身性纤维蛋白溶解、治疗高等优点。天然tPA由527个氨基酸组成，其中包含五个结构域分别是：1、指型区（F区，4-49位氨基酸）与纤维蛋白结合相关。2、表皮生长因子区（E区，50-86位氨基酸）与细胞膜受体结合有关。3、kringle1(K1区,87-175氨基酸)为肝脏受体结合部位。4、kringle2(K2区,176-261氨基酸)含有纤维蛋白结合位点。5、水解酶结构域区（SPD区，262-527氨基酸）催化纤溶酶原转化成纤溶酶，并且是PAI-1的结合位点。组织型纤溶酶原激活剂(tPA)是美国FDA在1987年批准作为治疗急性心肌梗塞的第一个基因工程重组的溶栓药物。1990年美国FDA又批准其用于治疗急性肺栓塞。1999年美国FDA再次批准其用于治疗急性缺血性卒中。并且是急性缺血性卒中目前唯一的溶栓治疗药物。但是，tPA在临床上的应用也表现出一定的局限性。其中主要是在病灶部位富集了大量的纤溶酶原激活剂抑制物(PAI-1),从而导致治疗性药物tPA很容易被PAI-1不可逆性抑制，迅速使其失去活性。在临床上，为了保证治疗效果，通常采用给病人注入高达100mg/50kg剂量。高剂量的tPA不仅会引起致命的颅内出血风险，而且会导致神经毒性副作用，从而提高了病人的死亡率。另外，在形成血栓过程中，大量的血小板被包含在血栓中。在伴随着凝血酶的刺激下，血小板不断被激活，释放出大量的PAI-1，同时也会导致血液中tPA药物的效价大大降低。虽然目前开发了一款具有抵抗PAI-1能力的TNK-tPA突变体.但是TNK-tPA突变体所包含的KHRR296-299突变为AAAA对PAI-1的抵抗能力还不够,并且没有表现出增强对纤溶酶原激活能力。因此，在临床上，仍然有巨大的需求去开发新的tPA类药物，可以用于治疗急性心肌梗塞、脑血栓、肺栓塞等疾病，在医学上进一步去提高其应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种组织型纤溶酶原激活剂突变体及其应用，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。为实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：该突变点位于tPA的水解酶结构域A146（氨基酸命名方式为Chymotrypsinogennumbering）位点。该tPA突变体包括A146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。以tPA的水解酶结构域为基础，将A146突变为Y为例子(即；tPA(A146Y))，其中氨基酸序列SEQIDNO.1为：IKGGLFADIASHPWQAAIFAKHRRSPGERFLCGGILISSCWILSAAHCFQERFPPHHLTVILGRTYRVVPGEEEQKFEVEKYIVHKEFDDDTYDNDIALLQLKSDSSRCAQESSVVRTVCLPPADLQLPDWTECELSGYGKHEYLSPFYSERLKEAHVRLYPSSRCTSQHLLNRTVTDNMLCAGDTRSGGPQANLHDACQGDSGGPLVCLNDGRMTLVGIISWGLGCGQKDVPGVYTKVTNYLDWIRDNMRP。获得的tPA(A146Y)突变体重组蛋白比野生型提高了75%的PAI-1抵抗能力、增强了5倍的纤溶酶原激活能力。以上所述146位氨基酸为Ala可以被取代为包括Tyr在内及Gly、Val、Leu、Met、IIe、Ser、Thr、Pro、Asn、Gln、Phe、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu中的任何一种。在本专利技术实施例中已经证明将Ala146位氨基酸的替代为Tyr，不仅能够显著性提高抵抗PAI-1的能力，而且能够增强激活纤溶酶原的能力。本专利技术的优点在于：本专利技术一种组织型纤溶酶原激活剂（tPA）的突变体，具有显著抵抗被其内源性抑制剂（PAI-1）抑制的能力和增强的激活纤溶酶原的能力。该突变体包括A146（氨基酸命名方式为Chymotrypsinogennumbering）位点是一个全新的突变位点，在此之前从未有人报道过。我们通过实施例实验证实，tPA(A146Y)突变体重组蛋白不仅具有显著性提高了75%的PAI-1抵抗能力，而且表现出一个新功能，即增强了5倍对纤溶酶原激活能力。该突变体可以应用于制备治疗血栓性疾病的药物，包括急性心肌梗塞、急性肺栓塞、脑卒中、及静脉血栓等疾病。附图说明图1：蛋白纯化后的SDS-PAGE电泳图，其中M为marker，1为tPA蛋白，2为tPA(A146Y)突变体蛋白。图2：化学发光底物法检测tPA(A146Y)突变体酶的活性。图3：tPA(A146Y)突变体对纤溶酶原激活能力的评价。图4：tPA(A146Y)突变体对PAI-1抵抗能力的检测。图5：体外血栓溶解实验。A为在正常血液中，tPA(A146Y)具有显著性的更强更快的血栓溶解能力比tPA。B为在加入外源性活性PAI-1的情况下，tPA(A146Y)的血栓溶解能力完全不受影响，而tPA-SPD的活性且被完全抑制了。说明tPA(A146Y)突变体蛋白具有非常强的PAI-1抵抗能力去促进血栓的溶解。具体实施方式下面将结合附图和实施例对本专利技术的方法和其优点作进一步说明，但这些实施例并不构成对本专利技术权利要求范围的限制。在不脱离本专利技术主要特征的范围下，本专利技术还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本专利技术保护的范围内。实施例1tPA(A146Y)突变体的构建、表达和纯化这里的tPA(A146Y)是以tPA的水解酶结构域(tPA-SPD)为基础进行A146Y突变，又简称为tPA(A146Y)，或tPA-SPD(A146Y)（氨基酸命名方式为C本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征在于：所述突变体的突变位点位于tPA的水解酶结构域Ala146位点，突变体包括Ala146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。
【技术特征摘要】
1.一种组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征在于：所述突变体的突变位点位于tPA的水解酶结构域Ala146位点，突变体包括Ala146在内至少一个及以上氨基酸残基的取代、缺失或添加。2.根据权利要求1所述的一种组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征在于：所述突变体的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。3.根据权利要求1所述的一种组织型纤溶酶原激活剂突变体，其特征在于：所述的人源组织型纤溶酶原激活剂，是指携带有Ala146突变的不同截断类型的人源tPA。4.根据权利要求1所述的一种组织型...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄明东，彭双周，袁彩，雪光浦，李金宇，
申请(专利权)人：福州大学，
类型：发明
国别省市：福建,35
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