包载SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球的制备制造技术

本发明专利技术公开了一种利用双乳化法制备包载SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球的制备方法，所述方法制备出来的微球表征指标良好，且能较好地保持SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物学活性。本发明专利技术摸索并确定了空载海藻酸钙微球制备的最佳配方，且成功制备了包载SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球。本发明专利技术中制备出的生物素化微球通过链霉亲合素的桥连作用锚定修饰在肿瘤病灶局部，通过在肿瘤局部持续释放SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα，从而达到增强机体抗肿瘤免疫的目的。

SA loaded mGM CSF SA and / or hTNF alpha biotinylated chitosan calcium alginate microspheres

【技术实现步骤摘要】
包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的制备
本专利技术属于医药制剂
，主要是包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球制剂的制备方法。
技术介绍
作为威胁人类身心健康的主要杀手之一，恶性肿瘤的病发率和致死率不断地上升，病患年龄也呈现减小趋势，一旦确诊给患者和家庭乃至社会都会带来极大痛苦与负担。恶性肿瘤的死因顺位在发达国家人口死亡的原因中排列第一位，在发展中国家中位列第二位[1]。所以癌症的研究和诊治已成为全球性的卫生事业钻研的重点。传统治疗手段以手术联合化疗和放射疗法的方式进行，虽然有一定的治疗效果，但是存在复发率高，对正常组织损伤大，肿瘤治疗针对性差和毒副损伤大等很多不足。很多科研工作者正不断探索和尝试更多新型治疗手段。肿瘤免疫治疗中经常用到各种细胞因子，它能够广泛调节各种免疫或非免疫细胞的功能，作用于机体的各种系统，增强免疫应答，更好地杀伤肿瘤。但是细胞因子的应用也存在一定的局限性：由于代谢较快，易受环境和蛋白酶影响，在体内维持的时间很短暂，不能稳定维持病灶的有效浓度，甚至可能产生不同程度的毒副损伤；其剂量水平在免疫治疗中起到关键作用：剂量过低会产生免疫耐受，剂量过高、大面积弥散会对机体产生免疫损伤或毒副作用。新型给药体系的研发具有重要意义，是当下研究的热点。海藻酸钠是一种天然的亲水性线性多糖，经FDA认证为一种安全的化合物，当海藻酸钠分子接触二价阳离子如Ca2+、Ba2+时可以很快形成囊状结构。包载蛋白的海藻酸钠凝胶可以维持蛋白较高的活性，同时调节其中蛋白类药物的缓慢释放。壳聚糖由于具有易于成膜、生物相容性好、可生物降解、产物无毒无害等特性，广泛应用于医药、化工、食品和环保等不同领域。壳聚糖的氨基可以进行生物素化修饰，也可以与海藻酸钠的羧基发生反应，制备出的海藻酸盐-壳聚糖复合微球。这种复合微球体系可以保护药物免受环境和蛋白酶的影响，满足治疗剂量的同时可以防止短时间浓度过高、弥散造成的损伤。此时，药物的吸收、利用和分布主要取决于载体材料性质，而不是药物本身的性质。海藻酸盐-壳聚糖复合微球还具有维持药物活性、控制药物缓慢释放、延长作用时间和增强靶向性等特性。粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(granulocyteandmacrophagecolonystimulatingfactor，GM-CSF)是免疫治疗中较为常用到的一种细胞因子，它可以调节单核、巨噬、造血和嗜中性、酸性粒细胞等多种细胞的生成，并影响其生命周期进程，同时有利于成熟细胞释放到外周血液中，可以提高DC抗原提呈能力，协调CD4+、CD8+T细胞的功能，和抗体参与的免疫反应。肿瘤坏死因子α(tumornecrosisfactorα，TNFα)对正常组织无害，对肿瘤细胞却可以直接杀伤并且抑制其增殖、生长，TNFα在体内可以使肿瘤细胞逐渐出血坏死，瘤体积逐渐减小甚至消失。本专利技术中选择SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα(m代表小鼠，h则代表人)为实验药物，制备了包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球；同时引入了生物素-亲和素反应系统-一分子的亲和素可以强力结合四分子的生物素，借助链霉亲合素(Streptavidin，SA)将微球锚定在肿瘤细胞膜表面，通过持续在病灶局部释放所包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα，从而增强机体的抗肿瘤免疫反应。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种制备包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的方法，保证制备出的微球表征指标良好，且制备过程能保持各细胞因子的生物学活性。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：1.空载海藻酸钙微球的制备。进行四因素三水平正交试验确定空载海藻酸钙微球制备的最佳配方。2.包载蛋白的海藻酸钙微球的制备。向海藻酸钠溶液中加入不同质量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα进行载蛋白海藻酸钙微球的制备，通过比较包封率和载药量确定两种蛋白的最佳投放量。3.包载蛋白的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的制备。将最佳投放量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα分散到海藻酸钠溶液中，同时将生物素化壳聚糖溶液分散到CaCl2溶液中，分别制备成w/o型乳液，然后混合，交联固化得到生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球。附图说明图1、包载SA-mGM-CSF/SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球作用示意图。图2、生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球电镜扫描图像和粒径分布图。具体实施方式通过以下实例进一步举例描述本专利技术，并不以任何方式限制本专利技术。凡在本专利技术的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本专利技术的保护范围之内。下述实例和实验所用的材料及设备如下：SA-mGM-CSF和SA-hTNFα蛋白原液：本人前期在实验室纯化、复性所得，与标准蛋白相比，细胞水平验证蛋白活性良好。EZ-LinkNHS-PEG4-Biotin生物素：美国Pierce公司。壳聚糖：美国Sigma公司。真空冷冻干燥机：德国Christ仪器设备有限公司。磁力搅拌器：德国IKA公司。实例1：正交试验进行空载海藻酸钙微球的制备。相关因素及对应水平如下：正交试验表具体实验流程：(1)用合适量程的量筒准确量取两份体积相等的液体石蜡，按照一定比例向两份液体石蜡中分别加入Span-80，4℃冷库内磁力搅拌10min，使其分散均匀。(2)磁力搅拌状态下，按照一定油∶水比例向其中一份液体石蜡中加入海藻酸钠溶液，同时向另一份液体石蜡加入CaCl2，继续磁力搅拌乳化30min，分别形成均匀w/o型乳液1、2。(3)将乳液1缓慢加入到乳液2中，继续磁力搅拌交联固化一段时间。(4)交联固化完成后，磁力搅拌状态下加入石油醚异丙醇混合液洗涤10min，静置分层后去掉上层乳浊液，重复操作2次，蒸馏水洗涤一次。(5)5000rpm4℃离心5min后去掉上清，得到微球沉淀。(6)得到的微球放于-80℃冰箱冷冻过夜后真空冷冻干燥。海藻酸钙微球制备的过程中，乳化剂用量为3％(v/v)，交联固化时间为3h，其他因素及相应水平参考上述正交试验表。微球冷冻干燥后进行电镜扫描，比较九组正交试验所得微球的形貌特征和粒径大小，确定空自爱海藻酸钙微球制备的最佳配方。实例2：包载蛋白的海藻酸钙微球的制备。分别向海藻酸钠溶液中投放不同质量的SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα，根据正交试验确定的最佳配方制备包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的海藻酸钙微球。准确称取一定质量真空冷冻干燥后微球，加入破囊液使其充分溶解，分别计算不同投放量所得微球的包封率和载药量，确定两种蛋白的最佳配方。实例3：包载蛋白的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的制备。具体实验流程：(1)用合适的量筒量取两份体积相等的液体石蜡，按照一定比例向两份液体石蜡中分别加入乳化剂Span-80，4℃冷库内磁力搅拌，使其分散均匀。(2)将SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα分散在海藻酸钠溶液中，作为内水相1，将生物素化的壳聚糖溶液分散在CaCl2溶液中得到内水相2。(3)磁力搅拌状态下，按照一定油∶水比例向其中一份液体石蜡本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用双乳化法制备生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球的方法，其方法、步骤如下：(1)用量筒量取两份体积相等的液体石蜡，按照一定比例向两份液体石蜡中分别加入乳化剂Span‑80，4℃冷库内磁力搅拌，使其分散均匀。(2)将SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα双功能融合蛋白分散在海藻酸钠溶液中，作为内水相1，将生物素化的壳聚糖溶液分散在CaCl2溶液中得到内水相2。(3)磁力搅拌状态下，按照一定油∶水比例向其中一份液体石蜡中加入内水相1，同时向另一份液体石蜡加入内水相2，磁力搅拌乳化30min便得到均匀的w/o型乳液1、2。(4)将乳液1缓慢加入到乳液2中，继续磁力搅拌交联固化一段时间。(5)交联固化完成后，磁力搅拌状态下加入石油醚异丙醇混合液洗涤10min，静置5min分层后去掉上层乳浊液，重复洗涤2次，蒸馏水洗涤一次。(6)5000rpm 4℃离心5min，去上清后得到包载SA‑mGM‑CSF或/和SA‑hTNFα的生物素化壳聚糖‑海藻酸钙微球的沉淀。(7)制备的微球样品放于‑80℃冰箱预冻过夜，真空冷冻干燥。

【技术特征摘要】
1.一种利用双乳化法制备生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的方法，其方法、步骤如下：(1)用量筒量取两份体积相等的液体石蜡，按照一定比例向两份液体石蜡中分别加入乳化剂Span-80，4℃冷库内磁力搅拌，使其分散均匀。(2)将SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα双功能融合蛋白分散在海藻酸钠溶液中，作为内水相1，将生物素化的壳聚糖溶液分散在CaCl2溶液中得到内水相2。(3)磁力搅拌状态下，按照一定油∶水比例向其中一份液体石蜡中加入内水相1，同时向另一份液体石蜡加入内水相2，磁力搅拌乳化30min便得到均匀的w/o型乳液1、2。(4)将乳液1缓慢加入到乳液2中，继续磁力搅拌交联固化一段时间。(5)交联固化完成后，磁力搅拌状态下加入石油醚异丙醇混合液洗涤10min，静置5min分层后去掉上层乳浊液，重复洗涤2次，蒸馏水洗涤一次。(6)5000rpm4℃离心5min，去上清后得到包载SA-mGM-CSF或/和SA-hTNFα的生物素化壳聚糖-海藻酸钙微球的沉淀。(7)制备的微球样品放于-80℃冰箱预冻过夜，真空冷冻干燥。2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤(2)中壳聚糖的生物素化方法：取5mgEZ-LinkNHS-...

【专利技术属性】
技术研发人员：高基民，马艾灵，
申请(专利权)人：温州医科大学，
类型：发明
国别省市：浙江,33