【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及组织工程材料领域，更特别地，涉及一种用于制备天然组织来源的骺软骨连骨脱细胞材料的试剂盒和脱细胞方法。
技术介绍
1、因感染、创伤和关节退行性改变等因素引起的关节炎可以对患者造成持续性疼痛和活动受限，严重影响患者运动功能及生活质量。据世界卫生组织估计，60岁以上的男性有9.6％，女性有18.0％患有症状性骨关节炎，80％的患者活动受限，25％的患者不能进行日常主要活动。关节软骨的愈合能力差，骨关节炎或软骨缺损后透明软骨自然愈合能力有限，而这些缺损可导致灾难性的退行性关节炎。关节炎的本质是因软骨退变或软骨缺损导致关节持续摩擦，导致软骨细胞死亡及其细胞外基质的退变及崩解，进而产生大量炎症介质，从而产生恶性循环。虽然现在已知它是一种复杂的疾病，影响到整个关节，包括软骨、软骨下骨、滑膜和韧带，关节软骨的机械性退化和软骨下骨的交替在其发病机制中起着关键作用。关节软骨和软骨下骨紧密连接，关节软骨的营养供应除了来自关节液以外，软骨下骨的支持也同样重要。软骨下骨的作用不仅仅一种机械支持的作用。最近的证据表明，软骨和软骨下骨之间的相互作用要复杂得多。软骨下骨产生的特异性分泌因子可以调节覆盖的软骨细胞的反应。而骨关节炎患者出现关节软骨缺损，软骨下骨坏死硬化甚至出现囊性变，因此关节软骨的退变炎症以及软骨下骨坏死导致关节软骨失去软骨下骨的营养支持，最终导致关节炎的持续加重，最终导致患者的残疾。因此治疗关节炎必须同时修复关节软骨和软骨下骨，否则在没有健康的软骨下骨作为支持，关节软骨将难以得到很好的修复。
2、目前临床上尚未有治愈骨
3、骺软骨是生长中的长骨两端干骺端的软骨组织,在次级骨化中心出现前关节软骨和骺软骨均来自于长骨两端的软骨，随着次级骨化中心的出现，两端软骨的微环境的改变分别向透明软骨和骨分化。骺软骨的静止区和增殖区中的软骨细胞能够分泌蛋白和蛋白聚糖从而形成以二型胶原为主要成分的软骨细胞外基质，与透明软骨的主要成分一致。而骺软骨肥大区的软骨细胞分泌十型胶原并迅速凋亡矿化，血管入侵该部位后成骨细胞和破骨细胞通过不断的成骨和破骨过程，最终将软骨基质改建成成熟的松质骨基质，而该过程与骨再生中软骨内成骨的修复过程十分相似。运用脱细胞技术制备细胞外支架为组织修复再生材料的制备提供可行思路，且目前能用于修复软骨联合骨的生物材料较少见报道，而骨骺连骨的生物材料修复骨关节炎则未见报道。
4、因此，需要一种新的骺软骨连骨生物材料的脱细胞制备方法和试剂，其不仅能去除异种组织的免疫原性，而且能最大限度地保留细胞外基质成分。
技术实现思路
1、本专利技术针对现有技术不足，提供了一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，包括脱细胞液a、脱细胞液b、脱细胞溶液c、脱细胞溶液d及脱细胞溶液e组成，其中所述脱细胞液a为体积分数为10-30％的丙酮溶液，脱细胞液b为含有体积分数1-2％的triton x-100的pbs缓冲液，所述脱细胞液c为含有质量分数为1-2％的hthops的pbs缓冲液,所述脱细胞液d为含有质量分数为1-3％的sds的pbs缓冲液，脱细胞试剂e为含有浓度为0.01-0.10mg/ml的dnaseⅰ及rnase的pbs缓冲液。
2、优选地，在所述a液中，所述丙酮溶液体积分数为20％。
3、优选地，所述triton x-100的体积分数为1％，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
4、优选地，在所述c液中，所述hthops的质量分数为1％，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
5、优选地，在所述d液中，所述sds的质量分数为1％，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
6、优选地，在所述e液中，所述dnaseⅰ及rnase的浓度均为0.01mg/ml，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
7、本专利技术还提供了一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞方法，使用上述试剂盒处理所述组织，包括用所述a液、b液、c液、d液及e液依次浸泡所述组织的步骤。
8、进一步地，所述方法包括以下步骤：
9、s1：用无菌水反复漂洗骺软骨连骨生物材料；
10、s2：用所述a溶液处理骺软骨连骨生物材料；
11、s3：用无菌水漂洗经s2处理的骺软骨连骨生物材料；
12、s4：用所述b液处理经s3处理的骺软骨连骨生物材料；
13、s5：用pbs漂洗经s4处理的骺软骨连骨生物材料；
14、s6：用所述c液处理经s5处理的骺软骨连骨生物材料；
15、s7：用pbs漂洗经s6处理的骺软骨连骨生物材料；
16、s8：用所述d液处理经s7处理的骺软骨连骨生物材料；
17、s9：用pbs漂洗经s8处理的骺软骨连骨生物材料；
18、s10：用所述e液处理经s9处理的骺软骨连骨生物材料；
19、s11：用pbs漂洗经s10处理的骺软骨连骨生物材料，即可得到去细胞骺软骨连骨生物支架。
20、优选地，所述方法包括以下步骤：
21、s1：用无菌水于温度为25℃条件下反复漂洗至少5次，每次5min；
22、s2：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述a溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡6小时；
23、s3：用无菌水漂洗经s2处理的骺软骨连骨生物材料5次，每次30分钟；
24、s4：将所述骺软骨连骨生物材料浸没于所述b溶液中，于温度为25℃条件下持续震荡48小时；
25、s5：用pbs本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：包括脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E组成，其中所述脱细胞液A为体积分数为10-30％的丙酮溶液，脱细胞液B为含有体积分数1-2％的Triton X-100的PBS缓冲液，所述脱细胞液C为含有质量分数为1-2％的3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙烷磺酸钠盐的PBS缓冲液,所述脱细胞液D为含有质量分数为1-3％的十二烷基硫酸钠的PBS缓冲液，脱细胞试剂E为含有浓度为0.01-0.10mg/ml的DNaseⅠ及RNase的PBS缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液A中，所述丙酮溶液体积分数为20％。
3.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液B中，所述Triton X-100的体积分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
4.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液C中，所述
5.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液D中，所述SDS的质量分数为1％，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
6.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液E中，所述DNaseⅠ及RNase的浓度均为0.01mg/ml，PBS缓冲液的浓度为0.01M。
7.根据权利要求1-6任一所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：所述的试剂盒处理骺软骨连骨生物材料，包括用所述脱细胞液A、脱细胞液B、脱细胞溶液C、脱细胞溶液D及脱细胞溶液E依次浸泡所述组织的骺软骨连骨生物材料。
8.根据权利要求7所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：
9.根据权利要求7所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：包括以下步骤：
10.根据权利要求7或8或9所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒的脱细胞方法，其特征在于：如权利要求1或中任一项所述用于去除组织细胞的去细胞方法，其特征在于，所述组织为猪骺软骨连骨生物材料。
...【技术特征摘要】
1.一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：包括脱细胞液a、脱细胞液b、脱细胞溶液c、脱细胞溶液d及脱细胞溶液e组成，其中所述脱细胞液a为体积分数为10-30％的丙酮溶液，脱细胞液b为含有体积分数1-2％的triton x-100的pbs缓冲液，所述脱细胞液c为含有质量分数为1-2％的3-烯丙氧基-2-羟基-1-丙烷磺酸钠盐的pbs缓冲液,所述脱细胞液d为含有质量分数为1-3％的十二烷基硫酸钠的pbs缓冲液，脱细胞试剂e为含有浓度为0.01-0.10mg/ml的dnaseⅰ及rnase的pbs缓冲液。
2.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液a中，所述丙酮溶液体积分数为20％。
3.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞液b中，所述triton x-100的体积分数为1％，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
4.根据权利要求1所述的一种用于骺软骨连骨生物材料的脱细胞处理的试剂盒，其特征在于：在所述脱细胞溶液c中，所述hthops的质量分数为1％，pbs缓冲液的浓度为0.01m。
5.根据权利要求1所...
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