本发明专利技术涉及新鉴定出的、能直接生产Ｌ－抗坏血酸（下文中也称为维生素Ｃ）的微生物。本发明专利技术还涉及包含下述基因的多核苷酸序列，所述基因编码维生素Ｃ合成中涉及的蛋白质。本发明专利技术还涉及：包含该新颖基因的全长多核苷酸序列的多核苷酸及其片段，所述多核苷酸编码的新颖的多肽及其片段，以及它们的功能等同物。本发明专利技术还涉及所述多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素Ｃ中的用途，其中对所述多核苷酸和／或被编码的多肽的修饰对微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和／或效率有着直接或间接的影响。本发明专利技术还包括使用多核苷酸和经修饰的多核苷酸序列转化宿主微生物的方法／工艺。本发明专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素Ｃ的用途。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】对维生素c的发酵生产本专利技术涉及多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素c中的用途，其中所述多核苷酸和/或被编码的多肽对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、产量和/或效率有着直接或间接的影响。本专利技术还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用于直接生产维生素c的用途。维生素c是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素c还 用于动物饲料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素c。在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素 C进行了工业生产。该工艺中的所有歩骤都是通过化学方式进行的，只除 了其中一个步骤(从D-山梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转 化来进行。从对维生素C的工业生产的最初实践开始，就已使用了多种化 学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对维生素C生产 的发展被概括于Ullmann，s Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27 (1996), pp. 547ff中。维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下 进行。因此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium 附属或 Gluconobacter 属的菌株从L-山梨糖起始来生产2-酮基-L-古洛酸(2-KGA，这是可通过碱性重排反应化学转化为维生素C的中间产物)，或者 通过属于Gluconobacter属或属的重组菌株，从D-葡萄糖起始进 行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛酸。目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征， 例如高能耗以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年屮， 人们已在研究更加经济且环保的用微生物转化来制造维生素C的其它方 法。从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来发酵生产 维生素C己在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类和酵母，其屮使用了不同的培养方法。但是，使用这些微生物的缺点在于产生的维生素 C的低产率，这是因为已知这些微生物既能生产2-酮基-古洛酸也能生产维生素C，所述微生物更容易合成2-KGA，因此通过微生物生产的维生素C 的产率受到相对高的2-KGA生产的限制，例如产生了小于0.1的维生素C 与2-KGA浓度比。因此，人们需要开发出具有更好的工业应用性的生产体系，该体系例 如可被操作以获得提高的效价和/或具有减少的发酵时间。 一种特别有用的 体系运用了编码与膜结合的L-山梨糖酮脱氢酶或与膜结合的PQQ结合D-山梨糖醇脱氢酶的基因。此类体系的一个例子使用了来自G/wco朋tecter my^朋N44-l的编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因(下文中称为SNDHai)， 该酶将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸。该基因及其同源体已被描述于WO 2005/017159中，该公开文本通过引用并入本文。人们持续需要进一歩更优化的发酵体系，用于对维生素C进行微生物 生产，以获得比上文描述的体系更高的产率。令人吃惊地，我们发现，在合适的培养条件下，表达SNDHai的宿主 细胞可用于进一步优化对维生素C的直接生产。这可通过对特定组的基因进行同时操作来达到，在本文中将对这些基 因进行进一歩描述。此类基因可选自由STS、 RCS、 SMS或VCS基因构 成的组。该组基因/蛋白质以及对每个组的操作将在本文中被进一歩描述和 举例。术语"直接发酵"、"直接生产"、"直接转化"等意指微生物能通 过一个或多个生物转化歩骤将某底物转化为特定的产物，而无需任何额外 的化学转化步骤。例如，术语"将D-山梨糖醇直接转化为维生素C"意在 描述下述过程，其中，微生物生产维生素C，并且，其中，D-山梨糖醇作 为碳源提供，而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单种 微生物是优选的。本文中使用的由遗传改变导致的"提高的"或"维生素C的提高的产 率"表示较之没有被遗传改变的微生物而言提高至少5%、 10%、 25%、 30%、 40%、 50%、 75%、 100%、 200%或者甚至超过500%。此类未被改变的细胞通常也被称为野生型细胞。因此，在第一个方面，本专利技术的目的是提供一种对维生素C进行直接 发酵生产的方法，所述方法通过在合适的培养条件下培养其基因组已被遗 传工程改造的宿主细胞，以及通过从此类细胞或培养基分离维生素C来实 现，所述遗传工程改造通过包含下述多核苷酸的DNA序列来进行a) 编码根据SEQ ID NO: 2的L-山梨糖酮脱氢酶或活性片段或其衍 牛物的多核苷酸，以及b) 编码选自下述组的蛋白质的至少一种多核苷酸，所述组由1 )涉及山梨糖/山梨糖醇代谢系统(Sorbitol/Sorbose Metabolization System, SMS)的蛋白质；2) 涉及穿过细胞膜的糖转运系统(Sugar Iransport System, STS)的 蛋白质；3) 涉及呼吸链系统(Respiratory Qiain System, RCS)的蛋白质；以及4) 显示出与甘露糖-l-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶或肌氨 酸氧化酶a亚基或同渗容摩(osmolality)传感器蛋白envZ rp426或转录调 控蛋白OmpR或PetP或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质构成。术语"遗传工程改造"或"遗传改变"表示对活的生物体中遗传物质 结构的科学改变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程改造或修饰的生物。遗传工程改造可通 过本领域已知的多种方法来进行，例如，基因替换，基因扩增，基因打 断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物， 例如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物，例如重组微生物。SMS蛋白是涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统(Sorbitol/Sorbose Metabolization System)的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在 本文中被縮写为SMS。 SMS蛋白在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢 中发挥作用。STS蛋白是涉及穿过细胞膜的糖转运系统(Sugar工ransport System)的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被縮写为STS。STS蛋白在对糖、糖醇和相关化合物穿过细胞膜或周质膜的转运中发挥作用。RCS蛋白是涉及呼吸链系统(Respiratory Qiain System)的蛋白。多 核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被縮写为RCS。 RCS蛋白在 生物的公知呼吸链(也被称为电子转移系统)中发挥作用。根据(b.4)的蛋白涉及维生素C生产系统(Yitamin ^ production System)。根据本专利技术的多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白在木文中被 縮写为VCS。迄今为止，人们没有认识到VCS蛋白参与维生素C的生 产，也没有认识到其参与与将碳源转化为维生素C相关的生物化学途径。在一种优选的实施方式中，以下述方式对选自STS、 RCS、 SMS或 VCS蛋白构成的组的蛋白的活性加以操作，所述方式使得所述宿主细胞生 产的维生素的产率和/或生产效率较之所述蛋白的野生型副本有所本文档来自技高网...
【技术保护点】
对维生素Ｃ进行发酵生产的方法，其中，在允许从能够从Ｄ－葡萄糖或Ｄ－山梨糖醇代谢途径获得的碳源直接生产维生素Ｃ的合适培养条件下，培养宿主细胞，并且，其中，所述宿主细胞的基因组被包含下述多核苷酸的ＤＮＡ序列进行了遗传工程改造： ａ）编码根据ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的Ｌ－山梨糖酮脱氢酶或其活性片段或其衍生物的多核苷酸，以及 ｂ）编码选自下述组的蛋白质的至少一种多核苷酸，所述组由 １）涉及山梨糖／山梨糖醇代谢系统（ＳＭＳ）的蛋白质； ２）涉及穿过细胞膜的糖转运系统（ＳＴＳ）的蛋白质； ３）涉及呼吸链系统（ＲＣＳ）的蛋白质；以及 ４）显示出与甘露糖－１－磷酸鸟苷酰转移酶／甘露糖－６－磷酸异构酶或肌氨酸氧化酶α亚基或同渗容摩传感器蛋白ｅｎｖＺ ｒｐ４２６或转录调控蛋白ＯｍｐＲ或ＰｅｔＰ或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质构成； 以及可选地，从此类细胞或所述培养基分离维生素Ｃ。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：玛丽加布里埃尔布泽林奥里夫，巴斯蒂恩切弗雷克斯，马诺拉达鲁埃格，玛丽娜哥德尔范，马卡斯戈瑟，克里纳豪克，波图斯皮埃特科克曼，康妮李，安妮弗兰克希斯梅耶，安佳穆利，奈杰尔约翰芒希亚，迪克希珀，新城雅子，克里斯廷托佩尔，阿德里安努斯维尔赫穆斯赫曼努斯沃勒，
申请(专利权)人：帝斯曼知识产权资产管理有限公司，
类型：发明
国别省市：NL[荷兰]
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