本发明专利技术公开了一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacteroxydans）TL-1045，还提供了该菌株在维生素C发酵生产中的应用。本发明专利技术提供的氧化葡糖酸杆菌TL-1045能够耐受高浓度的2-酮基-L-古龙酸，解除了维生素C发酵生产第二步中产物对菌体的反馈抑制，2-酮基-L-古龙酸的产量可达到125g/L以上，使得维生素C生产效率显著提高，有效降低了维生素C的生产成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型菌种一氧化葡糖酸杆菌TL-1045及其在维生素C发酵生产中的应用，具体为其在发酵制备维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸及维生素C中的应用，属于微生物发酵生产领域。
技术介绍
维生素C又称L-抗坏血酸，它能参与体内多种氧化还原反应及羟化反应，是一类重要的细胞代谢氧化还原化合物，在人体内起到必不可少的重要生理作用，如治疗人类坏血病，增强人体抵抗力。绿色植物能够自己合成维生素C，然而人和许多动物由于身体肝脏中缺少古洛内酯氧化酶，因此不能自己合成，必须从外界摄取。目前维生素C已广泛应用于 医药、食品、保健品和化妆品等领域。并且随着其用途的开发和人们物质文化生活水平的提高,对维生素C的需求量也不断增加。1933年，德国化学家Reichstein等专利技术了以化学合成法为主的莱氏法，是最早工业化生产维生素C的方法，但此法合成路线过长，有毒有害的中间产物以及有机原料消耗量多，需要生产商在环境污染防治方面进行较大的投入，导致维生素C生产成本较高。七十年代初，我国首创了维生素C 二步发酵法并将其应用于工业生产。该法在莱氏法一步发酵的基础上，采用混菌发酵，使山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸，工艺简单、成本低、无污染，是目前维生素C工业生产的主要方法。维生素C 二步发酵法，第一步是在醋酸杆菌作用下将D-山梨醇氧化为L-山梨糖，此步发酵工艺成熟，发酵周期约为20-30 h，且转化率很高，现已能达98%以上；第二步是将L-山梨糖进一步氧化生成2-酮基-L-古龙酸，此步发酵由两种微生物混菌发酵进行，一种为氧化葡糖酸杆菌，俗称小菌，另一种常采用巨大芽孢杆菌，俗称大菌。小菌能够转化山梨糖生成2-酮基-L-古龙酸，但其单独培养生长较弱；大菌不能产酸，但和小菌混合培养，能够显著促进小菌产酸。目前维生素C生产第二步发酵，发酵周期约为40-50 h，产物浓度约为80-95 g/L，转化率约为80-95%。第二步发酵周期长、产物浓度和转化率相对较低，因此是限制维生素C发酵生产效率的关键环节。为了进一步提高维生素C发酵的生产效率，近年来许多研究机构对维生素C第二步发酵进行了研究。专利200910148114. X公开了一种维生素C第二步发酵菌种制备方法，菌种茄瓶制备过程中，先将小菌接种茄瓶，培养16-48 h，然后再接种大菌，继续培养24-72h，这种条件下，可以提高小菌在混菌中的比例，提高菌种活力，发酵45 h，2-酮基-L-古龙酸可达到100 g/L，转化率达到90%左右，该方法效率有所提高，但是发酵时间较长。专利200910069697. 7公开了一种在发酵过程中添加巯基化合物来取代大菌促进小菌的生长和产酸，但其实际生产效率仍低于大、小菌混菌发酵的效率。专利200910034773. 0公开了一种强化2-酮基-L-古龙酸生产强度的方法，通过添加海藻糖，提高菌体对古龙酸的耐受性，发酵52 h，2-酮基-L-古龙酸可达到69. 38 g/L，该方法需要添加海藻糖，海藻糖价格较高，导致生产成本上升，不具有实用性。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中氧化葡糖酸杆菌对2-酮基-L-古龙酸耐受性较差，导致维生素C生产中第二步发酵效率低下的问题，提供了一种2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，该菌种2-酮基-L-古龙酸耐受性强，在二步发酵中转化L-山梨糖的效率高，所得2-酮基-L-古龙酸产率显著提高。本专利技术还提供了该菌种在维生素C发酵生产中的应用，具体为其在维生素C及其中间体2-酮基-L-古龙酸发酵制备中的应用。专利技术人经过大量实验研究，发现对2-酮基-L-古龙酸耐受性越强的氧化葡糖酸杆 菌菌株，其和巨大芽孢杆菌混菌发酵转化山梨糖生产2-酮基-L-古龙酸的效率越高，推测可能是2-酮基-L-古龙酸耐受性强的菌株解除了产物反馈抑制效应，使得在第二步发酵过程中后期，高2-酮基-L-古龙酸浓度下，菌体生长和合成产物效率提高。针对这一发现，专利技术人通过对现有生产菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347进行反复多次紫外诱变筛选，选育得到了本专利技术2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)TL-1045(即该菌种能耐高浓度2-酮基-L-古龙酸)。本专利技术氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacteroxydans) TL-1045,已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,保藏编号为CGMCC NO. 6188，保藏日期为2012年6月6日。以筛选得到的氧化葡糖酸杆菌TL-347为出发菌株，TL-347对2_酮基-L-古龙酸的耐受浓度为85 g/L，发酵生产2-酮基-L-古龙酸的产量约为95 g/L。氧化葡糖酸杆菌TL-1045的诱变筛选过程为挑取出发菌株氧化葡糖酸杆菌TL-347的单菌落，接入装有玻璃珠的无菌三角瓶中，加30 ml无菌生理盐水，150 rpm震荡20 min，将菌落打散，制成菌悬液。取菌悬液5 ml加入培养皿中，于40瓦紫外灯下,20-40 cm处照射I min、5 min、10 min,然后将三个处理的菌悬液分别稀释至10_3-10_5，涂布含有筛选培养基(2-酮基-L-古龙酸90-130 g/L，山梨糖15 g/L，胰蛋白胨3 g/L，尿素0.1 g/L，玉米浆4 8/1，牛肉膏1.2 g/L,酵母膏I. 2 g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.2 g/L，琼脂粉17 g/L,pH 6. 7)的平板中，避光培养72 h，挑取平板上的菌落，分别和巨大芽孢杆菌搭配，然后混菌接发酵摇瓶，检测发酵产2-酮基-L-古龙酸效率，将初步筛选的菌株反复多次诱变得到本专利技术中的2-酮基-L-古龙酸高耐受型氧化葡糖酸杆菌TL-1045，其在110 g/L或更高浓度的2-酮基-L-古龙酸中能够正常生长繁殖，其与巨大芽孢杆菌混菌发酵所得发酵液中2-酮基-L-古龙酸产量在125g/L以上，L-山梨糖对2-酮基-L-古龙酸的转化率在90%以上。对氧化葡糖酸杆菌TL-1045的分类学特征进行研究，如下 一、氧化葡糖酸杆菌TL-1045的菌体和菌落形态见表I。上述氧化葡糖酸杆菌TL-1045可用于维生素C发酵生产中，具体的为用其发酵生产维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸，步骤包括以巨大芽孢杆菌(简称大菌，下同)为伴生菌，与氧化葡糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans) TL-1045 (简称小菌,下同)组成混合菌种进行混菌有氧发酵，以L-山梨糖为原料进行混菌有氧发酵，将L-山梨糖转化为2-酮基-L-古龙酸。混菌发酵的培养基中除了 L-山梨糖外，还含有碳源、氮源、无机盐等营养成分。进一步的，维生素C中间体2-酮基-L-古龙酸的制备方法包括以下步骤 (1)菌种的活化将用茄瓶保存的巨大芽孢杆菌和氧化葡糖酸杆菌用活化培养基洗下，然后在活化培养基中于27-32°C下培养18-24 h，得活化的菌种液； (2)菌种的分离纯化在无菌条件下，用无菌生理盐水将步骤(I)得到的活化菌种液进行梯度稀释，取10_5-10_7稀释液0. I ml涂布在平板上，平板在27-32°C下培养4_6天； (3)混菌的培养用接种环将步骤(2)中10-25个平板上培养得到的全部氧化葡糖酸本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种2？酮基？L？古龙酸高耐受型菌种，其特征是：所述菌种为氧化葡糖酸杆菌（Gluconobacter？oxydans）TL？1045，该菌种已于2012年6月6日保藏至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？NO.6188。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张全景，付吉明，王乔隆，刘敏，郑秀宁，庄祎，
申请(专利权)人：山东天力药业有限公司，
类型：发明
国别省市：
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