基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法技术

本发明专利技术基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法，属于环境检测领域中重金属的生物学检测方法。先利用NHS/EDC对GO进行活化,暴露出GO表面的羧基，以利于DNA序列的结合，加入双氨基的多T部分双链序列和活化GO，使得双氨基的多T序列固定化结合在GO表面。加入不同浓度的Hg

Determination of mercury ion based on diamino fixed multi T sequence of graphene oxide

The invention is based on the method of detecting mercury ions by the diamino fixed multi T sequence of graphene oxide, which belongs to the biological detection method of heavy metals in the field of environmental detection. First, NHS/EDC was used to activate GO, exposing the carboxyl group on the GO surface, which is beneficial to the combination of DNA sequences, and adding multiple T partial double chain sequences of double amino groups and activating GO, so that the multiple T sequences of double amino groups are immobilized on GO surface. Adding different concentrations of Hg

【技术实现步骤摘要】
基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法
：本专利技术属于环境检测领域中重金属的生物学检测方法，基于氧化石墨烯(GO)固定双氨基化的多T序列(羧基荧光素—FAM标记)，来高灵敏性检测重金属汞离子。
技术介绍
：重金属离子对自然环境以及人类健康生活存在着巨大的威胁，其中的汞离子(Hg2+)广泛分布于空气、水域、土壤之中，因而被认为是危害生态环境最严重的金属阳离子之一。一系列的自然或人为过程导致了汞离子的毒性污染，如火山喷发、采矿、固体废弃物焚烧、燃烧化石燃料等。Hg2+在生物体内富集，会造成多种疾病，如大脑肾脏损伤、严重的认知和运动功能障碍、植物神经紊乱、水俣病等。(MingjianYuanetal.AColorimetricandFluorometricDual-ModalAssayforMercuryIonbyaMolecule.Org.Lett.2007,9,2313-2316；JianjunDuetal.ColorimetricDetectionofMercuryIonsBasedonPlasmonicNanoparticles.Small.2013,9,1467-1481)。因此，对人类息息相关的生态环境中汞离子的检测是非常重要的，发展一种高效、快速、低成本检测汞离子的技术至关重要。氧化石墨烯是石墨烯的一种衍生物，制作简单且成本较低，二维结构的氧化石墨烯表面积大，为DNA提供了众多的结合位点。使用NHS/EDC[N-羟基丁二酰亚胺、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐]活化GO表面，使得GO表面羧基化。双氨基修饰的多T序列特异性结合在活化的GO表面，由于汞离子能与多T序列形成-T-Hg2+-T-配对，导致DNA序列形成发夹结构，FAM标记的一端远离石墨烯表面，荧光恢复，随着汞离子加入的浓度不同，荧光发生相应的变化，本实验以此来检测汞离子。
技术实现思路
：一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，按照下述步骤进行：(1)氧化石墨烯(GO)活化：配制含50mMNHS与200mMEDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/mlGO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱。(2)双氨基序列固定:在10mM的PBS缓冲溶液，加入部分双链的双氨基多T序列和活化10ug/mlGO，4℃，过夜，离心，去上清，再加入等体积PBS缓冲液，混匀，测量其荧光强度。(3)汞离子检测及分析：向(2)中液体里加入不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析汞离子浓度，确定该传感器的灵敏度；再于(2)中的体系中加入适量的长江水，检测其汞离子浓度。步骤(2)中所述部分双链的双氨基多T|序列为5’NH2-GATAGCTTTGCTTGTTGCGCTTCTTGCTTT-FAM-3’；|||||||5’NH2-CTATCG-3’。步骤(2)中所述的GO浓度为10μg/ml。步骤(2)中所述的双氨基的多T部分双链序列浓度为50nM。本专利技术充分利用活化氧化石墨烯表面的羧基与修饰在多T序列上的双氨基特异性结合，大大增强了固定化效率。而汞离子能与多T序列形成-T-Hg2+-T-配对，导致DNA序列构象变化，形成发夹结构，FAM标记的一端远离石墨烯表面，荧光恢复。汞离子加入的量与荧光变化值呈正相关，基于此检测汞离子浓度。本专利技术具有以下优点：(1)本专利技术中氧化石墨烯纳米材料易于获得，方法简单、成本低。利用荧光共振能量转移(FRET)的原理，GO对DNA上的FAM荧光具有高效淬灭效率，双氨基修饰的多T列固定化效率高，利于汞离子检测。(2)本专利技术基于汞离子与多T序列的特异性，引起DNA构象变化，发夹结构形成时，FAM会远离GO表面，荧光强度有不同程度回复。(3)双氨基固定结合DNA构象变化能有效提高检测的信噪比，而实现对汞离子快速、低成本检测。附图说明图1该传感器检测0-10uM的汞离子的荧光图；图2该传感器检测0-10uM汞离子的回复率图；图3该传感器检测100nM同浓度的其它重金属离子与汞离子回复效果的对比；图4该传感器检测主要步骤示意图；(1.离心去除未吸附的DNA；2.加入可卡因,DNA构象变化,荧光恢复；3.注释)。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步说明，实施例是用于说明本专利技术，而不是用于限制本专利技术的范围。实施例：(1)合成特异的DNA序列：多T序列1：5’NH2-GATAGCTTTGCTTGTTGCGCTTCTTGCTTT-FAM-3’；多T序列2：5’NH2-CTATCG-3’。将同浓度的这两条单链序列于95度高温下五分钟，室温下静置两小时，杂交成部分双链DNA。(2)GO活化：配制含50mMNHS与200mMEDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/mlGO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱。(3)双氨基序列固定:200μl10mMPBS溶液，加入50nM双氨基的多T部分双链序列和10ug/ml活化GO，4℃，过夜，取出，10000rpm离心20min，去除上清液，加入等体积10mMPBS缓冲液，混匀。并测量其荧光强度。(4)汞离子检测及分析：首先向(2)中液体里加不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析该传感器的灵敏度。取适量长江水，经过滤去除其沉淀物。在200μl10mMPBS溶液加入50nM双氨基的多T部分双链序列和10ug/ml活化GO，4℃，过夜，取出，10000rpm离心20min，去除上清液，加入200μl长江水，混匀。测量其荧光强度，分析其汞离子浓度。序列表<110>江苏大学<120>基于石墨烯氧化物双氨基固定多T序列检测汞离子的方法<160>2<170>SIPOSequenceListing1.0<210>1<211>30<212>DNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<400>1gatagctttgcttgttgcgcttcttgcttt30<210>2<211>6<212>DNA<213>2AmbystomalateralexAmbystomajeffersonianum<400>2ctatcg6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于氧化石墨烯‑多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)氧化石墨烯(GO)活化：配制含50mM NHS与200mM EDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/ml GO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱；(2)双氨基序列固定:在10mM的PBS缓冲溶液，加入部分双链的双氨基多T序列和活化10ug/ml GO，4℃，过夜，离心，去上清，再加入等体积PBS缓冲液，混匀，测量其荧光强度；(3)汞离子检测及分析：向(2)中液体里加入不同浓度的Hg

【技术特征摘要】
1.一种基于氧化石墨烯-多T序列传感器检测汞离子的方法，其特征在于按照下述步骤进行：(1)氧化石墨烯(GO)活化：配制含50mMNHS与200mMEDC混合液，按NHS/EDC混合液：超纯水：1mg/mlGO＝1：1：2体积比例混合，常温下静置30min，洗脱；(2)双氨基序列固定:在10mM的PBS缓冲溶液，加入部分双链的双氨基多T序列和活化10ug/mlGO，4℃，过夜，离心，去上清，再加入等体积PBS缓冲液，混匀，测量其荧光强度；(3)汞离子检测及分析：向(2)中液体里加入不同浓度的Hg2+，混匀，静置20min，检测荧光强度，通过荧光强度的变化来分析汞离子浓度，确定该传感器的灵敏度...

【专利技术属性】
技术研发人员：高力，邓泽斌，黎雪琴，李娆琪，施海峰，周阳，张春霞，时海霞，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32