一种预测纤维素结晶度的方法技术

本发明专利技术公开了一种预测纤维素结晶度的方法，该预测方法通过构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针，可以与各种预处理的纤维素进行结合，通过荧光检测，即可对纤维素的结晶度进行预测。本发明专利技术方法只需通过荧光检测即可对纤维素的结晶度进行预测，解决了纤维素经过XRD测定时可能会改变结晶度以及无法测定含水样品等问题，为纤维性改性、加工及处理等提供重要的理论依据，具备商品化的开发潜力。

A method for predicting the crystallinity of cellulose

The invention discloses a method for predicting the crystallinity of cellulose, the prediction method by constructing unit - fluorescent protein probe combined with carbohydrates, can be combined with various pretreatment of cellulose, by fluorescence detection, prediction of the degree of crystallization of cellulose. The method of the invention only by fluorescence detection on the crystallization degree of cellulose can be predicted, solved by XRD determination of cellulose may change the crystallinity and cannot measure the problem water samples, fibrous modification, processing and processing provide an important theoretical basis, with commercial development potential.

【技术实现步骤摘要】
一种预测纤维素结晶度的方法
本专利技术属于生物能源领域，涉及一种利用碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针与纤维素进行结合，通过荧光检测即可预测纤维素结晶度的方法。
技术介绍
纤维素是地球上最古老、最丰富的天然高分子，是取之不尽用之不竭的人类最宝贵的天然可再生资源。纤维素是一种由重复的D-葡糖酸糖分子组成的线性大分子，它与1,4-糖基键相连，是大多数植物所制造的木质纤维素材料的主要成分，是生物燃料工业的主要潜在原料。纤维素结构特点：纤维素是由β-D-吡喃型葡萄糖基(失水葡萄糖)组成。简单分子式为(C6H10O5)n。纤维素与很多其他高聚物一样是多晶，即由无数微晶体与非晶区交织在一起的。其结晶的程度视纤维品种而异。天然纤维素，如苎麻的结晶度略高于70％，而再生纤维素如粘胶纤维则只有35％左右。纤维素结晶度在一定程度上反应纤维的物理力学和化学性能，也直接影响材料的性能，是评价生物质材料性能和纤维品质的重要依据。纤维素链之间的氢键以及葡萄糖分子之间的范德华力等作用力使得纤维素形成了有序的晶体区域和相关的晶格。目前广泛使用的测量纤维素结晶度方法主要有：x射线粉末衍射(XRD法)，红外光谱法(IR)，固态13C核磁共振法，密度测量法，振动和频率生成(SFG)光谱，以及最近发展起来的红外拉曼检测。纤维素结晶度测定之后还需使用不同软件进行计算，计算方法主要包括：切线法，高度法，分峰法等等。碳水化合物-结合模块(CBM)是一种多肽模块，在许多碳水化合物活性酶中发现，它可以与不同的碳水化合物结合。CBMs的主要功能是促进基质联合和催化活性酶对基质的催化效率。具有结合纤维素的CBMs可分为三种类型:A型CBMs可以与晶体纤维素结合，B型CBMs包含与非晶态纤维素区域相关联的单聚糖链，而C型CBMs只与小的糖结合。本专利技术所使用的CBMs类型为A型和B型。现有方法均没有提及通过荧光测定即可预测纤维素结晶度的方法。本专利技术为了定量研究纤维素的结晶度，我们设计了可以与纤维素进行结合的荧光蛋白探针，利用对荧光强度的测量对二者的吸附率进行了计算，并观察了吸附率与XRD结晶之间的线性关系，由此可以对纤维素的结晶度进行预测。本专利技术的方法不但方便快捷，适应范围也更加广泛，样品可以无需干燥，也无需研磨，避免了在干燥和研磨过程中造成的结晶度的损失和下降，同时，更加避免了在获得数据后在处理数据过程中的人为误差。可以说本方法无论是在样品处理过程还是在数据处理过程都大大提高了数据的准确性。如此便捷准确的纤维素结晶度预测方法，在生物质能源利用过程中尤为重要，其商业化应用前景也随之凸显。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种预测纤维素结晶度的新方法。为此，本专利技术提供了一种碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针与纤维素进行结合，通过荧光检测即可预测纤维素结晶度的方法。所述方法包括先将所述纤维素通过酸处理、碱处理或球磨处理后获得经预处理的纤维素，并将其与制备好的荧光蛋白探针相结合，通过测定其荧光强度变化进而预测其结晶度。一种预测纤维素结晶度的方法，其步骤为：先构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针，为后续纤维素结晶度预测做准备；再通过荧光蛋白探针与纤维素底物结合前后上清中荧光强度的变化率来表示探针与纤维素底物的结合率，通过建立二者结合能力与纤维素标准品结晶度的线性关系，利用线性关系对纤维素样品的结晶度进行预测。对于上文所述的技术方案，所述碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针是对CBM编码基因进行全基因合成获得，再与荧光蛋白编码基因融合，表达形成可以与处理过纤维素进行结合的荧光探针。对于上文所述的技术方案，所述的将合成的CBM编码基因与荧光蛋白编码基因融合表达的方法为：分别全基因合成CBM和荧光蛋白的编码基因，首先利用重叠延伸PCR将两部分基因利用5×甘氨酸连接臂进行融合。随后将融合的基因连接至带有亲和纯化标签的大肠杆菌表达载体中，并转化到大肠杆菌菌株中进行表达和亲和纯化。对于上文所述的技术方案，所述蛋白质纯化用的标签包括组氨酸标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。对于上文所述的技术方案，所述的碳水化合物结合单元CBM包括CBM1、CBM2a、CBM3、CBM17和CBM28中的一种或多种。CBM后面的数字代表一个家族蛋白，例如CBM17家族可以从不同来源的微生物中获得。在本专利技术的实施例中的CBM编码基因，源自一株耐热的褐色高温单孢菌Thermomonosporafusca和一株约氏梭菌Clostridiumjosui。对于上文所述的技术方案，所述的荧光蛋白包括绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧光蛋白中的一种或几种。所述荧光蛋白探针与纤维素底物结合条件为：在pH5.5-8.5浓度1-30mM的磷酸缓冲液中加入浓度为5-50μg/mL的荧光蛋白探针，反应温度为20-60℃，反应时间为0-100min；所述纤维素底物需经过前处理，前处理方法包括酸处理、碱处理和球磨处理中的一种或多种。其中，所述酸处理过程是将所述纤维素在60％-85％磷酸0-25℃搅拌1-3h进行预处理，然后再加入0℃的丙酮进行搅拌，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；所述碱处理过程是将所述纤维素在1-30％的氢氧化钠溶液中，0-25℃搅拌0-12h进行预处理，然后除去氢氧化钠之后，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；所述的球磨处理过程是将所述纤维素的样品中加入(0.4-0.6mm)的玻璃珠，在20-30℃下以200-400rpm的速度处理2-12h，滤除玻璃珠后，最后经洗涤和冻干得到预处理的纤维素；所述荧光探针与纤维素底物结合能力的定量分析是通过对二者结合后的反应体系上清中荧光强度的变化进行测定，计算吸附率，获得与结晶度的线性关系。所述的处理好的纤维素与荧光探针的结合能力的定量分析是指通过对结合好的纤维素和荧光探针进行荧光强度的测定，将吸附率与结晶度进行计算获得线性关系。所述的结晶度预测是指通过获得的线性关系对该纤维素的结晶度进行预测。在一个优选实施方案中，所述纤维素为微晶纤维素、α纤维素、滤纸、秸秆纤维和松木纤维的天然纤维素或者半天然纤维素中的一种或多种。在一个优选实施方案中，所述荧光探针与纤维素的结合能力的定量分析是通过对二者结合后的样品进行荧光强度的测定之后计算获得的。探针和纤维素的吸附率是通过相关的荧光强度计算得来的。吸附率(％)＝100×(荧光强度对照-荧光强度终浓度)/荧光强度对照在一个优选实施方案中，所述荧光强度的测定条件为激发波长395nm，发射波长为475nm。有益效果：本专利技术的方法首先对纤维素样品进行预处理，使之与构建的碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针相结合，对纤维素与其结合能力进行定量分析，之后通过对荧光强度的测定即可对纤维素样品的结晶度进行预测，该方法可以应用到各种纤维素样品。本方法对纤维素样品要求低，无需烘干，也不会在测量结晶度过程中由于测量方法使结晶度造成损失，预测得到的纤维素结晶度结果与XRD测定的结晶度结果线性关系良好，既是准确可信的新方法，又为没有条件进行XRD测定的单位和个人提供方便便捷的方法，仅仅通过荧光强度的测量即可预测结晶度，为纤维素更好在应用提供了基础。附图说明图1是本专利技术的实施例1中的碳水化合物结合单元—荧光蛋白荧光探针的结构示意图；图2是本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种预测纤维素结晶度的方法，其特征在于：A、构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针；B、通过荧光蛋白探针与纤维素底物结合前后上清中荧光强度的变化率来表示探针与纤维素底物的结合率，通过建立二者结合能力与纤维素标准品结晶度的线性关系，利用线性关系对纤维素样品的结晶度进行预测。

【技术特征摘要】
1.一种预测纤维素结晶度的方法，其特征在于：A、构建碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针；B、通过荧光蛋白探针与纤维素底物结合前后上清中荧光强度的变化率来表示探针与纤维素底物的结合率，通过建立二者结合能力与纤维素标准品结晶度的线性关系，利用线性关系对纤维素样品的结晶度进行预测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物结合单元—荧光蛋白探针是先对CBM编码基因进行全基因合成获得，再与荧光蛋白编码基因融合，表达形成可以与处理过的纤维素进行结合的荧光探针。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的将合成的CBM编码基因与荧光蛋白编码基因融合表达的方法为：分别全基因合成CBM和荧光蛋白的编码基因，首先利用重叠延伸PCR将两部分基因利用5×甘氨酸连接臂进行融合；随后将融合的基因连接至带有亲和纯化标签的大肠杆菌表达载体中，并转化到大肠杆菌菌株中进行表达和亲和纯化。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述蛋白质纯化用的标签包括组氨酸标签、GST标签和MBP标签中的一种或多种。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述碳水化合物结合单元为CBM1、CBM2a、CBM3、CBM17和CBM28中的一种或多种；所述荧光蛋白为绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白和青色荧...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨帆，郭小宇，李宪臻，
申请(专利权)人：大连工业大学，
类型：发明
国别省市：辽宁,21