一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法技术

本发明专利技术属于食品快速检测领域，公开了一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法。本方法选用别藻蓝蛋白作为荧光指示剂，与抗氧化剂竞争由AAPH释放出的自由基，从而导致别藻蓝蛋白自身的荧光衰退时间延后，以未含有抗氧化剂的衰退曲线为空白，计算两者AUC差值，建立标准曲线并进行实际样品的检测。本发明专利技术的优点：别藻蓝蛋白属于长波长荧光指示剂，其激发波长为653nm，发射波长为668nm，可以避开实际样品中自发荧光物质的干扰；具有高的pH稳定性；对内外猝灭不敏感。以上优点很大程度上提高了检测灵敏度。

A method of detection of antioxidant capacity by long wavelength algin cyanin fluorescence

The invention belongs to the field of fast food detection, and discloses a method for detecting antioxidant capacity by using long wavelength algin cyanin to detect the antioxidant capacity. This method uses allophycocyanin as a fluorescent indicator, and the competition by the AAPH release of antioxidant free radicals, resulting in allophycocyanin fluorescence decay its time delay, not containing antioxidants decay curve of blank, calculated AUC value, establish the standard curve and detection of real samples. The advantages of the invention are: phycocyanin is a long wavelength fluorescent indicator, its excitation wavelength is 653nm, and the emission wavelength is 668nm, which can avoid the interference of the spontaneous fluorescence substance in the actual sample, has high pH stability, and is not sensitive to internal and external quenching. The above advantages increase the detection sensitivity to a large extent.

【技术实现步骤摘要】
一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法
：本专利技术属于食品快速检测领域，涉及到一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法。
技术介绍
：ORAC是氧化自由基吸收能力(OxygenRadicalAbsorbanceCapacity)的缩写，氧化自由基吸收能力又称为抗氧化能力。ORAC分析方法是根据自由基破坏荧光探针，使荧光强度产生变化原理，以维生素E水溶性类似物Trolox(dro-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid)为定量标准，使用荧光微孔板分析仪进行分析。荧光强度的变化大小反映自由基破坏的程度。在抗氧化剂存在时，其可以抑制由自由基引起的荧光变化。抑制程度反映了其对自由基的抗氧化能力。B-藻红蛋白在早期研究中被使用作为荧光指示剂，虽然其具有水溶性好，荧光强度大和对氧自由基灵敏度高等优点，但是由于其具有光敏性，在光照下会很快自发消退，使其难以进行定量计算。后来人们在实验中还发现，B-藻红蛋白会以疏水或氢键作用。与天然界中的一大类抗氧化物质——多酚类非特异性结合，而且对不同物质不同量表现不同的亲和力，所以现在不常使用。荧光素由于其高稳定性和价格低廉，是迄今为止最常用的方法，然而该荧光指示剂发光波长落于中短波长范围内，受到在400-550nm范围内来自样品基质的静态背景信号的影响，导致最终的测定结果不准确。而使用长波长的荧光指示剂可以有效的解决这一问题。在ORAC分析方法中，自由基来源主要为偶氮类化合物2,2'-azobis-2-amidinopropane-dihydrochloride(AAPH)热分解产生的过氧自由基，产生的自由基可以与荧光指示剂反应形成荧光猝灭。采用抗氧化剂作用下的荧光衰退曲线下面积(areaunderthecurve，AUC)与荧光自然衰退曲线下面积的差，即AUC净＝AUC样品-AUC空白,作为衡量抗氧化剂的抗氧化能力指标，将结果以抗氧化物质Trolox作为标准进行表达，由此来反映样品的抗氧化能力。本方法选择的别藻蓝蛋白(APC)是一种深蓝色粉末。别藻蓝蛋白属于长波长荧光指示剂，其激发波长为653nm，发射波长为668nm，可以避开实际样品中自发荧光物质的干扰；具有高的pH稳定性；对内外猝灭不敏感。以上优点很大程度上提高了检测灵敏度。
技术实现思路
：本专利技术针对荧光素发光波长落于中短波长范围内，可能会受到来自样品基质的静态背景信号影响的问题，提供一种检测结果稳定，准确率高，精密性好，检测范围宽，适用于快速检测酒水或果汁抗氧化能力的方法。为了实现上述目的，本专利技术提出了一种利用别藻蓝蛋白这一长波长且具有更强荧光强度的物质作为荧光指示剂来检测抗氧化能力的方法，其特征在于，具体步骤为：(1)配制pH＝7.0的PBS缓冲液，144nM别藻蓝蛋白溶液，128nMAAPH溶液，100μMTrolox溶液和实际样品溶液。(2)在96孔酶标板中依次加入适量磷酸缓冲液，APC溶液和Trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入AAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。(3)导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至Origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(AUC净)。附图说明图1为检测的别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的示意图图2为本专利技术荧光指示剂在不同浓度的维生素E的体系中荧光强度随时间衰退曲线以及标准曲线具体实施方式：为了能够更清楚的理解本专利技术的
技术实现思路
，下面对本专利技术的具体实施方法作进一步说明。(1)PBS缓冲液(pH＝7.0)的制备称取3.1202g磷酸二氢钠和7.1628g十二水合磷酸氢二钠定容至100ml配制而成。将其放置于4℃冰箱中保存。(2)别藻蓝蛋白(APC)溶液的制备量取10μLAPC(10mg/ml)溶于500μL缓冲液中，浓度为144nM，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(3)AAPH储备液的制备称取0.174gAAPH溶于5ml缓冲液中，浓度为128nM，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(4)Trolox储备液的制备量取5.26μL维生素E溶液(800mg/ml)溶于100ml无水乙醇中，浓度为100μM，将其用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(5)实际样品的制备使用缓冲液将样品进行稀释溶解，在14000r/min的条件下离心15分钟。取上清液部分，用锡箔覆盖置于4℃冰箱中保存。(6)标准曲线的建立和实际样本的检测实验在96孔酶标板中进行，依次加入适量磷酸缓冲液，APC溶液和Trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入AAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。所有样品和标准曲线重复进行三次独立测定。(7)数据处理导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至Origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(AUC净)。并通过整合AUC数据得到标准曲线。利用标准曲线计算得到样品抗氧化能力的Trolox当量值。(8)性能分析检测范围本方法标准曲线的线性范围是0.75-10.0μM，决定系数(R2)为0.993。如要准确的确定样品中抗氧化能力的Trolox当量值，Trolox当量值应不超过0.75-10.0μM的范围，超出此范围的测定结果是通过标准曲线外延得出的计算结果。精密度的检测实例1向96孔酶标板其中一孔依次加入150μLPBS缓冲液，15μL144nMAPC溶液，15μL干红葡萄酒稀释液(稀释1500倍)，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入20μLAAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。同时进行三次平行测定。实例2向96孔酶标板其中一孔依次加入150μLPBS缓冲液，15μL144nMAPC溶液，15μL葡萄汁稀释液(稀释1000倍)，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入20μLAAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。同时进行三次平行测定。样品ORAC-APCaORAC-FLa白酒1.45±0.071.14±0.11干红葡萄酒17.72±0.7011.9±0.78白葡萄酒1.92±0.321.24±0.24黄酒7.35±0.796.12±0.27橙汁5.44±0.684.98±0.09葡萄汁8.76±0.917.48±0.14本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)别藻蓝蛋白(APC)储备液的制备使用磷酸缓冲液将别藻蓝蛋白配置至144nM，将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(2)AAPH储备液的制备使用磷酸缓冲液将AAPH配置至128nM将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(3)Trolox储备液的制备使用无水乙醇将维生素E配置至100μM，将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(4)实际样品的制备使用磷酸缓冲液将实际样品进行稀释溶解，离心，取清液部分。将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(5)标准曲线的建立和实际样本的检测实验在96孔板酶标板中进行，依次加入适量磷酸缓冲液，APC溶液和Trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入AAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。所有样品和标准曲线重复进行三次独立测定。(6)数据处理导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至Origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(AUC净)。并通过整合AUC数据得到标准曲线。利用标准曲线计算得到样品抗氧化能力的Trolox当量值。...

【技术特征摘要】
1.一种利用长波长别藻蓝蛋白荧光检测抗氧化能力的方法，其特征在于包含以下步骤：(1)别藻蓝蛋白(APC)储备液的制备使用磷酸缓冲液将别藻蓝蛋白配置至144nM，将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(2)AAPH储备液的制备使用磷酸缓冲液将AAPH配置至128nM将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(3)Trolox储备液的制备使用无水乙醇将维生素E配置至100μM，将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(4)实际样品的制备使用磷酸缓冲液将实际样品进行稀释溶解，离心，取清液部分。将以上配好的溶液放置于冰箱中保存并用锡箔覆盖待用。(5)标准曲线的建立和实际样本的检测实验在96孔板酶标板中进行，依次加入适量磷酸缓冲液，APC溶液和Trolox溶液或待测样品，在37℃条件下静置15分钟，随后立即加入AAPH溶液。将酶标板立即放入多功能读板器并开始检测。每次读数之前，酶标板自动摇动。每5分钟记录一次荧光，持续2小时。所有样品和标准曲线重复进行三次独立测定。(6)数据处理导出数据并对数据进行归一化处理，将数据输出至Origin软件计算得到荧光衰减曲线下面积(AUC净)。并通过整合AUC数据得到标准曲线。利用标准曲线计算得到样品抗氧化能力的Trolox当量值。2.根据权利要求1所述的抗氧化能力检测方法，其特征在于：步骤(1)～(4)中的磷...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴继魁，宋人君，徐蓁禾，罗磊，张俊玲，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31