融合高光效和抗早衰性状的水稻育种方法技术

本发明专利技术涉及一种融合高光效和抗早衰性状的水稻育种方法。是将早衰相关基因导入优质的水稻种质中，获得抗早衰的水稻株系；再将具有Ｃ↓［４］植物ＰＥＰＣ基因稳定表达的水稻种质与其杂交，获得Ｆ１杂种；然后进行生理鉴定，筛选出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料；将筛选出的具有两种优良生理特性的Ｆ１通过花粉培养，得到稳定的具有两种优良生理特性的花培株系；对花培株系进行生理鉴定，筛选后获得融合高光效和抗早衰优良生理性状的水稻纯系。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生理育种领域，尤其是一种通过基因工程、常规育种和生理鉴定有机结合，培育一种。
技术介绍
水稻品种矮秆化和籼型杂交稻的三系配套是现代水稻育种史上的两个重要里程碑，它们使水稻产量大幅度的提高。我国水稻平均产量已达到6t/hm2，江苏已超过8t/hm2，叶面积指数均达8～10左右，再通过增加群体叶面积提高产量已相当困难。分析现有高产水稻品种的光能利用率在1～1.5％，而理想的光能利用率可达3～5％，可见，提高水稻光合效率可能是今后提高水稻产量的有效途径之一。 众所周知，植物的多数性状，尤其是农作物的产量、品质性状，受多基因控制。要改良这些数量性状，仅靠改变其中的某个基因是很难奏效的，而必须同时对控制性状的多个编码基因，甚至调控基因进行遗传转化，并使它们在转基因植株及其后代中稳定地表达和遗传才能达到预期的目的，这不仅需要大量的研究工作来证实，而且聚合多个基因还会遇到基因沉默的现象，不仅影响转化的效果，而且还耗资巨大。最近的资料显示，通过基因工程将玉米C4光合基因导入水稻是一个有效的提高光合效率的途径。 根据CO2同化方式的不同，高等植物分为C3，C4和景天酸(CAM)植物，其中，C4植物具有光合效率高、CO2补偿点低、几乎没有光呼吸等优点，特别在强光、高温、干旱等条件下，C4植物具有明显的生长优势及水分和营养利用率，生物学产量也较高，作物生理和育种学家长期致力于将C4光合特性导入C3作物以提高其光合效率。但科内作物C4植物玉米和C3植物水稻的杂种由于染色体不规则配对或遗传障碍而表现不育，因此，通过常规育种上难于奏效。近十年来，C4光合途径的一系列关键酶即磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、NADP-苹果酸(NADP-ME)和丙酮酸磷酸双激酶(PPDK)基因的克隆及其表达特征已有深入研究。特别是C4光合基因成功导入C3植物研究的重大突破，其中转玉米PEPC基因水稻的PEPC活性高达原种的44-81倍，是C4植物玉米的PEPC活性的2-3倍，氧抑光合也下降了20％，种子产量比原种提高10-40％的转基因水稻材料。随着高表达的转玉米的PEPC基因水稻的稳定选育，越来越多的研究结果证实了高表达转玉米PEPC基因水稻具有高光效特性在我国夏季高光强和高温的自然条件下，转PEPC基因水稻植株具有高光效特性且产量提高10-20％，它在光抑制条件下耐光抑制能力增强，而且通过利用转PEPC基因的水稻材料的遗传研究也表明PEPC基因是期关键酶，它决定的水稻高光合能力的高效表达，而且携带PEPC基因水稻的高光效特性是可以稳定的遗传的，焦德茂、高东迎、李霞等在2001年12月21日针对“转入C4植物PEPC基因的水稻能稳定表达的育种方法”申请了国家专利技术专利，并被授予专利权，专利号为ZL011380128。 近几年，我国的超级稻育种取得了巨大的进展，一批优质、高产品种相继育成，为解决我国乃至世界的粮食问题做出了重要贡献。但大多数超级稻生育后期遭遇低温易出现茎叶青枯，发生早衰，严重地影响着超级稻产量的发挥。通过遗传改良，控制水稻的早衰发生将是进一步提高水稻产量的有效途径之一。 不少亚种间超级稻在生育后期，叶片容易黄化，生理表现为叶绿素和蛋白质含量下降较快，导致光合速率明显下降，不仅影响灌浆，而且严重地影响了作物的产量和品质。研究表明光合作用相关基因，如rbcs(Rubisco小亚基)和cab(叶绿素a/b结合蛋白)基因衰老过程中转录水平降低。利用差别筛选和缩减杂交技术(SSH)，人们已从拟南芥、油菜、马铃薯、大麦、番茄、黄瓜、小麦、水稻、玉米等作物中鉴定得到了衰老期间表达增加的基因，这些基因通常被称为衰老相关基因(SAGs)或衰老上调基因(senescence-upregulated genes)，但现在常规有关延缓衰老的方法多从栽培的水肥控制，导入上述衰老相关基因的研究多停留在理论研究中，因为这些基因的表达与特定的因素相关，有些只在自然衰老过程中表达，有些在特定的逆境诱导衰老过程中表达，如只在水分、营养等特定的胁迫下才表达，因此，单纯通过基因工程获得稳定的抗早衰材料还是非常困难，而且在农业育种上的适应性有限。 最近的研究表明谷胱甘肽在控制植物体内的活性氧分子水平起重要的作用，谷胱甘肽在植物抵御强光、低温和土地贫瘠等非生物氧化逆境胁迫都能引起剧增，在仅含野生种5％的谷胱甘肽的缺失突变体，表现为对氧化逆境更敏感，谷胱甘肽分子似乎所具有对氧化逆境“遇激而增”的信号分子的感知特征，谷胱甘肽可与活性氧物质起化学反应，与酶催化偶联的还原型谷胱甘肽(GSH)对H2O2的脱毒起关键的作用，GSH自身巯基的氧化形成氧化型谷胱甘肽(GSSG)，防止由氧化逆境诱导的蛋白的变性，从而保护蛋白。从谷胱甘肽代谢的酶的基因克隆和转基因的研究表明增加了转基因植株的谷胱甘肽的合成能力，可以阻止其叶绿体内的氧化逆境的发生。用超表达的内质网结合蛋白或反义的内质网结合蛋白的转基因植物的研究表明超表达的内质网结合蛋白通过GSH等巯基蛋白的掺入，可能帮助光合机构阻止内源的氧化逆境。这一成果在水稻育种过程中如何运用尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于针对目前水稻普遍存在的光合效率低，易衰老，尤其是易衰老直接影响到水稻的产量和品质的实际问题，我们借助已有的ZL01138012.8号专利技术，深入研究，提供一种。 我们的研究表明水稻早衰发生的敏感性与谷胱甘肽同系物的变化具有很高的相关性，γ-谷氨酰胺半胱氨酸合成酶基因(γ-ECS)是谷胱甘肽的合成途径关键步骤中的限速酶，只要能在水稻品种中导入γ-ECS基因，就能诱导水稻内的谷胱甘肽的合成，控制水稻早衰。 本专利技术的目的是这样实现的一种，其特征在于 a)将早衰相关基因导入优质的水稻种质中，获得抗早衰的水稻株系；b)将具有C4植物PEPC基因稳定表达的水稻种质与具有抗早衰特性的水稻株系杂交，获得F1杂种；c)对F1杂种进行高光效和抗早衰特性的生理鉴定，筛选出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料；d)将筛选出的具有两种优良生理特性的F1通过花粉培养，得到稳定的具有两种优良生理特性的花培株系；e)对稳定的花培株系进行高光效、抗早衰的生理鉴定，筛选后获得融合所述两个优良生理性状的水稻纯系。 在本专利技术中根据本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种融合高光效和抗早衰性状的水稻育种方法，其特征在于：ａ）将早衰相关基因导入优质的水稻种质中，获得抗早衰的水稻株系；ｂ）将具有Ｃ↓［４］植物ＰＥＰＣ基因稳定表达的水稻种质与具有抗早衰特性的水稻株系杂交，获得Ｆ１杂种； ｃ）对Ｆ１杂种进行高光效和抗早衰特性的生理鉴定，筛选出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料；ｄ）将筛选出的具有两种优良生理特性的Ｆ１通过花粉培养，得到稳定的具有两种优良生理特性的花培株系；ｅ）对稳定的花培株系进行高光效、抗早衰的 生理鉴定，筛选后获得融合所述两个优良生理性状的水稻纯系。

【技术特征摘要】
1所述的融合高光效和抗早衰性状的水稻育种方法，其特征在于所述的优质的水稻种质是苏沪香粳；所述的将早衰相关基因导入优质的水稻种质中是指通过农杆菌介导的方法将玉米的γ-ECS基因转入苏沪香粳中；所述的将早衰相关基因导入优质的水稻种质中，获得抗早衰的水稻株系是指通过农杆菌介导的方法将玉米的γ-ECS基因转入苏沪香粳中获得抗早衰的水稻株系后，通过测定开花7天和21天时剑叶的叶绿素含量和原初光化学效率，筛选出Fv/Fm衰减不高于10％或叶绿素含量衰减不高于20％的抗早衰材料H1，并使H1代繁衍到H2，获得携带γ-ECS基因的水稻植株。 在本发明中所述的将具有C4植物PEPC基因稳定表达的水稻种质与具有抗早衰特性的水稻株系杂交是指具有C4植物PEPC基因稳定表达的水稻种质为父本，以携带γ-ECS基因的水稻植株为母本。 在本发明中所述的进行高光效和抗早衰特性的生理鉴定，筛选出具有高光效和抗早衰特性的水稻材料是指通过测定C4光合酶活性和叶片光合速率，以及测定开花7天和21天时剑叶原初光化学效率(Fv/Fm)和叶绿素含量，筛选出PEPC活性在250～1099μmol/mgChl.h之间，光合速率数值在16.2～30.8μmol/m2.s之间，同时Fv/Fm衰减不高于10％或叶绿素含量衰减不高于20％的水稻材料。 在本发明中所述的将筛选出的具有两种优良生理特性的F1通过花粉培养，得到稳定的具有两种优良生理特性的花培株系是指选取F1单核期的稻穗，放入4℃下处理10天，然后接种于H8的培养基中，诱导出愈伤组织，再转入分化培养基MS6中分化成苗，获得的花培苗种植后，保留二倍体，从而获得稳定的花培株系。 在本发明中所述的H8培养基的配方为以M8为基本培养基，附加2，4-D 1mg/L+萘乙酸(NAA)3mg/L+细胞分裂素(KT)1mg/L+脱落酸(ABA)3mg/L+脯氨酸100mg/L+水解酪蛋白300mg/L+蔗糖50g/L+琼脂8g/L；所述的MS6培养基配方为以MS为基本培养基，附加2mg/LKT+1mg/L NAA+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。 本发明的优点在于克服了聚合多个基因可能带来的费用和沉默的不足，结合常规杂交，生理鉴定和花药培养的特点，形成一种快速有效植物育种方法。以水稻为例，在中国现有高产栽培条件下，各种优良超级稻组合不断涌现的今天，优良生理性状的发挥程度是关系到品种的产量的发挥和推广范围的关键因素。但每个生理性状的发挥又是遗传和环境共同作用的结果，即使通过分子生物学和基因工程的现代生物技术也难以改良，而且将作物中鉴定得到的很多衰老相关基因(SAGs)或衰老上调基因(senescence-upregulated genes)，都导入水稻既花费巨大，而且多基因聚合还会出现基因沉默，难以达到预计的结果，而本方法通过单一关键基因的表达和优良生理形状建立对应关系，将两个材料进行简单的融合，克服了基因多基因导入带来的基因沉默、常规育种方法的周期长和植物生态环境的差异造成的生理性状的不稳定的难题，通过单个关键基因的导入分别获得具有一个优良生理性状的材料，从而克服不同品种间的遗传障碍，既花费低，又便于育种者实施，通过花药的培养，将自然和人工条件下筛选的材料稳定，不仅减少了工作量，而且克服了常规杂交育种周期长的不足，从提高了选种的精准性和育种效率。具体实施方式实施例1 γ-ECS基因向苏沪香粳的转入2003年，将玉米的，γ-ECS基因转入，具体方法如下将苏沪香粳的水稻成熟种子去壳，经75％酒精处理1min后用0.1％氯化汞溶液浸泡15min，再用无菌水漂洗3遍，接种到以M8为基本培养基，激素的种类与配比的诱导愈伤组织培养基上(诱导成熟胚愈伤组织的配方为M8+2mg/L2，4-D1mg/LABA+1mg/L6-BA，3％蔗糖+7％琼脂)28℃黑暗条件下培养30d。从种子胚盾片部位切下诱导出的黄白色致密愈伤组织，浸入到携带γ-ECS基因的农杆菌株GV3010的菌液中，浸染5分钟，然后共培养48h，再接入含有500mg/L头孢霉素和50mg/L的卡那霉素的筛选培养基中(筛选培养基配方除了含抗生素外，其他的和成熟胚诱导培养基的配方成分相同)，3 week后，成功转入γ-ECS的愈伤组织即成活成为抗性愈伤组织，没有转入基因的愈伤即死亡，将抗性愈伤组织，转接到分化培养基中，(分化培养基配方为MS+2，4-D0.2mg/L+6-BA2.0mg/L+KT2.0mg/L+蔗糖30g/L，pH5.6)，2 week后诱导成苗，即为携带γ-ECS的水稻植株。将这些植株种植到大田中，通过测定开花7天和21天时剑叶的叶绿素含量和原初光化学效率(Fv/Fm)，筛选出Fv/Fm衰减不高于10％或叶绿素含量衰减不高于20％的抗早衰材料H1，收种子，为了加快获得种子，将H1代种子在冬季到海南基地种植，获得H2代种子，实现了一年中收获两代材料。 将苏沪香粳和γ-ECS-苏沪香粳采用基因扩增(PCR)的方法首先进行基因的分子鉴定，γ-ECS基因的表达是以该基因在相同质量下基因扩增的量为标准判定的，根据NCBI基因银行获得γ-ECS的登陆号为AJ302783.，通过该基因的序列设计了一个右边界PCR引物，引物的序列为5’-AGGAGCGCCACTAAGTTCAA和一个左边界的引物，引物序列为5’-TGCAAAGTTGCCTTTCCCTTT，通过PCR的方法鉴定，以未转基因的苏沪香粳的基因表达电泳图片的黑白的亮度为1，与转γ-ECS的水稻材料对比，获得转基因的表达强度。结果(参见表1)显示γ-ECS-苏沪香粳与未转基因的苏沪香粳相比，具有明显的抗早衰性。 表1 γ-ECs-苏沪香粳抗早衰性的鉴定所述的抗早衰特性主要是通过测定叶绿素荧光参数Fv/Fm和叶绿素含量的衰减判定。 叶绿素荧光参数Fv/Fm的测定用FMS2荧光仪(Hansatech，UK)测定叶绿素荧光动力学参数。作用光1200μmol·m-2·s-1，饱和脉冲光4000μmol·m-2·s-1，闪光(0.9μmol·m-2·s-1)2s，间隔30s，每个材料3次重复。荧光动力学参数按下式计算Fv/Fm(Fm-F0)Fm，其中F0为初始荧光强度，Fm为最大荧光强度，Fv为可变荧光强度。原初光化学效率的衰减＝(Fv/Fm7-Fv/Fm21)/Fv/Fm7)*100％叶绿素含量的测定于水稻开花的第一天开始挂牌，在开花的第7天和21天，分别取剑叶上10个叶圆片，每个叶圆片直径为0.5cm，放入10ml96％的乙醇中在容量瓶中抽提，在暗中30℃抽提7天，然后在分光光度计上测定665和649nm的光吸收，从而测定叶片的叶绿素含量，叶绿素的衰减＝(Chl7-Chl21)/Chl7)*100％实施例2 γ-ECS-苏沪香粳/转PEPC基因水稻的F1的获得2004年，以实施例1获得的具有抗早衰的材料H2种质作为母本，根据焦德茂、高东迎、李霞等申请的ZL01138012.8号专利公开的方法获得的具有C4植物PEPC基因稳定表达的水稻种质为父本，通过杂交，获得112粒杂种F1种子。 实施例3高光效和抗早衰特性的F1筛选2004年冬季在海南种植了全部由实施例2获得的112粒杂种F1材料，通过在抽穗期鉴定叶片的PEPC活性、光合速率，在开花期测定剑叶开花后第7天和21天后叶绿素含量以及Fv/Fm，筛选出55株高光效和抗早衰的水稻材料F1材料，筛选出的材料PEPC活性均在260～1099μmol/mgChl.h之间，光合速率数值在17.2～29.8μmol/m2.s之间，Fv/Fm衰减在5％～10％、叶绿素含量衰减在12-20％，均具有高光合效率和抗早衰特性，证明可以通过有性杂交，获得组合两种优良生理特性的材料。 高光效特性的鉴定是通过测定C4光合酶PEPC活性和叶片光合速率。 光合速率的测定用LI-6400光合测定系统，测定水稻孕穗期连体倒2叶的光合CO2气体交换。气源为压缩空气(CO2体积分数为350μl/L)，光源为卤素灯，通过调节灯与叶室之间的距离来改变到达叶表面的光强。灯与叶室之间有一流动水槽以减少到达叶室的温度(叶室温度保持在30℃，相对湿度为60％)，光量子通量密度(PFD)、系统CO2体积分数均由该系统直接测出，测定800μmol/m2.s光强下的光合速率，每一点测定4-6个重复。 PEPC活性的测定取水稻抽穗...

【专利技术属性】
技术研发人员：李霞，周月兰，王超，孙志伟，郭士伟，何冰，焦德茂，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]