本发明专利技术公开了一种泛菌属菌Ｐａｎｔｏｅａ ｓｐ．Ｍ３（ＣＣＴＣＣ Ｎｏ．Ｍ２０７０２２）。这种细菌具有降解孔雀石绿的能力。取对数期该菌株，按２％～４％的重量百分比浓度添加到浓度为０．５ｍｇ／Ｌ～５ｍｇ／Ｌ的灭菌孔雀石绿降解培养液中，降解培养液组成按ｇ／Ｌ计为：葡萄糖０．５～１；ＮａＣｌ０．０１～０．１；ＭｇＳＯ↓［４］０．０１～０．１；ＮＨ↓［４］ＮＯ↓［３］０．０２～０．１；Ｋ↓［２］ＨＰＯ↓［４］０．０１～０．１；ＫＨ↓［２］ＰＯ↓［４］０．０１～０．１；酵母膏０．０６～０．３；ｐＨ值６．０～８．０。２０～３０℃降解５～１０天孔雀石绿，降解效果较好。本发明专利技术可有效去除渔业水体中残留的孔雀石绿及其主要代谢产物隐孔雀石绿，对低浓度孔雀石绿渔业水体具有很好的处理效果，该菌株对０．５～２ｍｇ／Ｌ的孔雀石绿降解率在９０％以上。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及泛菌属的新菌株，还涉及该菌株在降解孔雀石绿中的应用。
技术介绍
孔雀石绿(malachite green，MG)作为杀真菌剂曾广泛应用于水产养殖业。MG进入生物体后，转化生成隐孔雀石绿(leucomalachite green，LMG)。MG及LMG在生物体组织中积累起来，不易代谢，具有致癌、致突变作用。加拿大欧盟等国均规定在食用水产品中禁止检出MG及其LMG。我国于2002年5月将MG列入《食品动物禁用的兽药及其化合物清单》。由于MG的代谢周期缓慢，一般鱼塘多年难以根本消除。因此，对渔业水域中MG的残留问题也应当加以高度重视。目前处理水中孔雀石绿的主要方法有物理方法，化学方法和生物方法。物理方法主要是通过吸附，沉降作用去除。化学方法主要有光助Fenton反应，异相光催化，光电催化，电化学方法等。但是这些处理方法投资大、流程复杂，物理吸附并未能将孔雀石绿分解去除，吸附后废水中仍有孔雀石绿残留，而且容易造成二次污染。因此，人们采用微生物的方法降解MG。细菌降解孔雀石绿的报道很少。一项德国专利技术专利(Akad.Wiss.Microbial breakdown of xenobiotic dyes oftriphenylmethane series.German patentPN290004，PY1991.05.16.)筛选得到分枝杆菌Mycobacterium sp.和棒状杆菌属Corynebacterium sp，对于20mg/L孔雀石绿，在24℃可以在2h内使脱色率达到47％，在32℃，pH 6.8，22小时内，完全脱色。Rajesh筛选得到一株库尔特氏杆菌能够降解孔雀石绿(Rajesh，1999)，该菌可在30min内完全使0.365～1.825mg/L的孔雀石绿完全脱色。Sun-YoungAn1等2002年发现一株柠檬酸杆菌属(Citrobacter)可完全脱色3.65mg/L的孔雀石绿。但是现有的微生物处理方法主要集中于MG的脱色研究，检测方法也多用紫外分光光度法，精确度不高，而且对其主要代谢产物LMG没有同时检测。代谢产物隐孔雀石绿同时降解后的检测的研究未见报道。
技术实现思路
1、要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种降解孔雀石绿高效、快速的细菌及其使用方法，利用该菌能够有效降解孔雀石绿。2、技术方案采用的技术方案如下一种泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022保藏单位中国典型培养物保藏中心，保藏日期2007年3月12日)，其具有降解孔雀石绿的能力。该菌种的主要特征为菌体呈短杆状，革兰氏染色阴性，兼性厌氧，过氧化氢酶、V.P.试验、MR试验、柠檬酸盐阳性，氧化酶、吲哚试验阴性，葡萄糖发酵产酸产气，不能水解淀粉。富集培养基上菌落呈白色圆形，边缘平滑，表面凸起，边缘整齐。在该培养基上30℃培养24h，菌落直径1mm～3mm.不能以孔雀石绿作为唯一碳源生长。提取细菌总DNA，以细菌总DNA为模板，PCR扩增16S rDNA，扩增引物为细菌通用引物。正向引物为27f5′-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’；反向引物为1492r5′-TACCTTGTTACGACTT-3’。PCR产物经电泳检验后委托上海博雅生物技术有限公司进行测序，将所得测序序列结果提交GeneBank，得到M3的16S rDNA序列的Genebank编号EF192586。本专利技术采用先富集后筛选的方法获得该菌株。其步骤如下1)从多次喷洒过孔雀石绿的鱼塘底泥中，取适量鱼塘底泥接种于含0.04mg/L MG的富集培养基中，30℃、150rpm黑暗培养。富集培养基的配方为(mg/L)葡萄糖1000；NaCl 10；MgSO410；NH4NO3100；K2HPO4100；KH2PO4100；酵母膏60；pH 7.0。2)待培养液混浊且颜色转浅后，将悬浊液转接至下一批次新鲜培养液中(同步骤1中)，并逐步加大MG浓度，如此重复，直至MG浓度达5mg/L。3)驯化后得到的混合培养物经富集培养基平板涂布分离和纯化，最终筛选得到MG高效降解菌株。4)经生理生化及16S rDNA鉴定，确定上述菌株是泛菌属(Pantoeasp.)M3.保存在富集培养基的斜面，使用前外加以外加孔雀石绿(0.5mg/L)的上述培养基进行驯化。该菌种培养方法为富集培养液灭菌(同上)，30℃接种菌株M3，150rpm摇床培养至对数期。用于降解孔雀石绿的方法取对数期该菌株，按2％～4％的重量百分比浓度添加到浓度为0.5mg/L～5mg/L的灭菌孔雀石绿降解培养液中，降解培养液组成按g/L计为葡萄糖0.5～1；NaCl 0.01～0.1；MgSO40.01～0.1；NH4NO30.02～0.1；K2HPO40.01～0.1；KH2PO40.01～0.1；酵母膏0.06～0.3；pH值6.0～8.0。20～30℃降解5～10天，降解效果较好。3、有益效果本专利技术提供了一种用于高效降解孔雀石绿的细菌泛菌属菌Pantoea sp.M3(CCTCC No.M 207022)，本专利技术可有效去除渔业水体中残留的孔雀石绿及其主要代谢产物隐孔雀石绿。本专利技术对低浓度孔雀石绿渔业水体具有很好的处理效果，对温度适应范围比较广。该菌株对20～30℃的0.5～2mg/L的孔雀石绿降解率在90％以上。使用方法方便，降解性能稳定，可同时降解孔雀石绿主要代谢产物隐孔雀石绿。本专利技术所涉及细菌已提交保藏保藏单位中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期2007年3月12日，保藏编号CCTCC No.M 207022。附图说明图1为葡萄糖浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；图2为葡萄糖浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；图3为NH4NO3浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；图4为NH4NO3浓度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；图5为不同磷浓度条件下对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；图6为不同磷浓度条件下对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响；图7为温度对对泛菌属菌Pantoea sp.M3生长的影响；图8为温度对泛菌属菌Pantoea sp.M3降解孔雀石绿的影响。具体实施例方式以下通过实施例进一步说明本专利技术实施例1取适量鱼塘底泥接种于含0.04mg/L MG的富集培养基中，30℃、150rpm黑暗培养。待培养液混浊且颜色转浅后，将悬浊液转接至下一批次新鲜培养液中，并逐步加大MG浓度，如此重复，直至MG浓度达5mg/L。驯化后得到的混合培养物经富集培养基平板涂布分离和纯化，最终筛选得到MG高效降解菌株M3。实施例2将菌株接种于5mg/L的孔雀石绿富集培养基中，活化至对数期，培养基成分按mg/L计为葡萄糖1000；NaCl 10；MgSO410；NH4NO3100；K2HPO4100；KH2PO4100；酵母膏60；pH 7.0。将所得菌液按2％～4％的重量百分比浓度接入含孔雀石绿0.5～5mg/L孔雀石绿培养基中，培养5天后测定降解率，可分别达到97.54％，97.1％，100％和77.8％，可见该菌对孔雀石绿特别是较低浓度的孔雀石绿降本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种泛菌属菌Ｐａｎｔｏｅａｓｐ．Ｍ３（ＣＣＴＣＣＮｏ．Ｍ２０７０２２），其具有降解孔雀石绿的能力。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杨柳燕，任倩，张彤晴，潘建林，蒋丽娟，吴光红，宋炜，肖琳，林海，周刚，
申请(专利权)人：南京大学，
类型：发明
国别省市：84[中国|南京]
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