一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法技术

本发明专利技术涉及一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法；固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。将两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂混合形成混合液，并与四氧化三铁溶液按照体积比3：5～3：10的比例混合；将含有四氧化三铁的混合溶液进行紫外照射或者加热或常温放置，使单体通过交联聚合包埋四氧化三铁，形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。本发明专利技术提供的酶固定化方法继承了传统共价结合法固定化酶的优点，酶活力回收率较高，具有较高的应用价值。

A kind of amphoteric ion magnetic composite hydrogel immobilized enzyme carrier and preparation method

The invention relates to an amphoteric ion magnetic composite hydrogel immobilized enzyme carrier and a preparation method thereof; enzyme immobilization is amphoteric hydrogel encapsulating Fe3O4 nanoparticles; with two functional groups of glutaraldehyde, end and zwitterionic hydrogels connected, one end and the surface of the enzyme amino Schiff base formation, the surface of the enzyme covalently linked to the hydrogel carrier. The zwitterionic monomer, crosslinking agent, initiator and solvent to form a mixed solution, and solution according to the volume ratio of 3:5 to Fe3O4 3:10 ratio mixing; mixed solution containing Fe3O4 by UV irradiation or heating or placed at room temperature, the monomer through crosslinking polymerization of embedding Fe3O4, formed encapsulating Fe3O4 the zwitterionic magnetic composite hydrogel immobilized enzyme carrier. The enzyme immobilization method provided by the invention has inherited the advantages of the traditional covalent binding enzyme immobilized enzyme, and the enzyme activity recovery rate is high, and has high application value.

【技术实现步骤摘要】
一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体及制备方法
本专利技术涉及一类包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。本专利技术涉及该载体的制备方法和应用。更具体的说，本专利技术涉及一类包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体的制备方法以及用所述方法制备的载体固定酶的用途。
技术介绍
酶是一类重要的生物催化剂，能够参与生物体内多种代谢反应，具有作用条件温和、高效性、专一性、来源广泛等优点。酶被人们广泛应用于酿造、医药、食品加工、化学分析、环境保护、能源开发等领域。但是天然酶多是蛋白质类，蛋白质类酶的高级结构对于环境十分敏感，多种因素(如物理、化学、生物等)都易使酶失活变性；并且酶在反应结束后混入产品中，难以分离纯化，不能重复利用。为了克服这些缺陷，酶的固定化技术应运而生。酶的固定化技术是重要的酶稳定化手段，与游离酶相比，固定化酶具有以下优点：1)稳定性提高；2)容易分离回收；3)可多次重复使用，降低成本；4)操作连续可控；5)相对于游离酶，固定化酶更适合于多酶反应。在酶的固定化技术中，用于酶固定的载体的性质会在很大程度上影响固定化酶的性质。用于酶固定化的载体通常要具有以下特性：1)具有能和酶反应的官能团；2)较好的渗透性和较大的比表面积；3)水和有机溶剂不溶性；4)热稳定性及化学稳定性；5)对微生物的抵抗性；6)可重复使用性；7)良好的生物相容性。张秋禹等固定化载体材料的最新研究进展(材料导报，2006)；罗贵民等酶工程(第三版，化学工业出版社，2016)。酶固定化载体从最初的天然高分子材料，到后来的合成高分子材料、无机材料，再到现在的复合材料，虽然已经得到了广泛的应用，但是仍具有或多或少的缺陷：1)天然高分子材料中应用较多的有壳聚糖、海藻酸钠、明胶、卡拉胶等。壳聚糖的强度不高，并且容易被酶降解；海藻酸钠和钙形成的凝胶在含有多价阴离子或者高浓度强电解质溶液中不稳定，钙离子容易脱离，从而使凝胶分解；明胶则具有较密实的内部结构，如果作为包埋酶的介质凝胶，会影响传质；卡拉胶则稳定性差、易降解。2)合成高分子材料的应用也非常广泛，如聚丙烯酰胺凝胶、聚乙烯醇凝胶等。合成高分子材料的生物相容性不高，比如丙烯酰胺单体对生物体有神经毒性。3)无机载体材料的结构不易调控，影响传质，键合酶的能力差，对酶活影响较大。以上提到的酶固定化材料还有一些共同的缺陷，如不能抗蛋白吸附，在表面固定酶时，容易使酶吸附在载体表面；生物相容性不高等等。杨勇，李彦锋等酶固定化技术用载体材料的研究进展(化学通报,2007(4):257-263)。在传统固定方法的基础上，开发研究性能优异的载体材料，已经成为固定化酶技术目前最为活跃的研究方向之一。目前，已经涌现出了许多用于酶固定化的新型载体材料，其中磁性材料和亲水性材料是两个重要的研究方向。1)磁性材料具有特殊的磁响应性，可以借助外部磁场从反应体系中快速简单地富集、分离、回收固定化酶，提高酶的使用效率。不足之处在于，磁性材料的生物相容性差，不能为蛋白提供良好的亲水性环境，不利于酶很好地发挥生物学活性；并且磁性材料不能抗蛋白吸附，当用于固定化酶载体时，容易引起酶蛋白的非特异性吸附从而使蛋白结构扭曲，造成一定程度的失活；2)亲水性载体具有良好的生物相容性，能够提高底物对酶的亲和力，有利于为酶促反应创造良好的微环境。已经有人将亲水性长链引入到酶固定化载体上，从而创造适宜酶活性构象的微环境，用这种方法已经使得环己酮单加氧酶、嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶更加稳定。杨勇，李彦锋等酶固定化技术用载体材料的研究进展(化学通报,2007(4):257-263)；孙建华,戴荣继等酶固定化技术研究进展(化工进展,2010,29(4):715-721)。两性离子水凝胶具有许多非常明显的优势，最新研究表明，两性离子水凝胶具有超亲水的特性，能够很好的给酶创造一个亲水微环境，微环境的优化对于酶发挥催化活力具有十分重要的作用。两性离子水凝胶的生物相容性非常好，用两性离子修饰的蛋白质药物进入人体之后，能够提高药动学特性，降低免疫原性，提高蛋白的稳定性。在复杂的基质(如血清)中进行生物标记检测时，两性离子水凝胶具有超低的吸附特性和很高的抗体装载量。两性离子水凝胶还能在不降低蛋白质和作用物的亲和力以及生物活性的前提下，很好的提高蛋白质的稳定性。S.Jiang等Zwitterionicpolymersexhibitinghighresistancetononspecificproteinadsorptionfromhumanserumandplasma(Biomacromolecules.9(2008)1357-1361)；S.Jiang等Functionalizableandultrastablenanoparticlescoatedwithzwitterionicpoly(carboxybetaine)inundilutedbloodserum(Biomaterials.30(2009)5617-5621)；S.Jiang等Zwitterionicgelencapsulationpromotesproteinstability,enhancespharmacokinetics,andreducesimmunogenicity(P.Natl.Acad.Sci.USA.112(2015)12046-12051)；S.Jiang等Poly(zwitterionic)proteinconjugatesofferincreasedstabilitywithoutsacrificingbindingaffinityorbioactivity(Nat.Chem.4(2012)60-64)；S.Y.Jiang等Superlowfoulingsulfobetaineandcarboxybetainepolymersonglassslides(Langmuir.22(2006)10072-10077)。两性离子材料的诸多优势，使其有望成为固定化酶的优良载体材料。但是至今未有人将其应用于酶固定化领域。并且，单纯使用两性离子材料作为酶固定化载体，不易从反应体系中分离，不具有可重复操作性。因此，迫切需要一种新型的兼具亲水性-磁性的酶固定化载体材料，使得其制备的固定化酶容易从体系中分离，并能保持良好的生物学活性，较高的稳定性和生物相容性、以及对底物较高的亲和性。
技术实现思路
本专利技术针对现有用于酶固定化载体的不足，首先提供了一种超亲水-磁性酶固定化载体。如图1、图2所示：本载体的特征在于，载体的主要基质两性离子单体聚合而成的水凝胶(1)，水凝胶内包埋有四氧化三铁纳米颗粒(2)。一方面提供这种新型的酶固定化载体材料的制备方法。本专利技术另一方面提供了按照本专利技术方法生产的载体固定酶。这种固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子(2)的两性离子水凝胶(1)。具有双功能基团的戊二醛(3)，一端和两性离子水凝胶(1)相连，一端和酶(4)表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。本专利技术提供的固定化载体，其特征在于该载体以两性离子水凝胶为主要基质(1)，通过包埋四氧化三铁纳米粒子(2)，使其具有磁响应性，便于从体系中分离。本专利技术的技术方案如下：一种两性离子磁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体；其特征是固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。

【技术特征摘要】
1.一种两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体；其特征是固定化酶的载体是包埋有四氧化三铁纳米粒子的两性离子水凝胶；具有双功能基团的戊二醛，一端和两性离子水凝胶相连，一端和酶表面的氨基形成席夫碱，将酶共价连接在水凝胶载体的表面。2.权利要求1的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体的制备方法，其特征是包括如下步骤：(1)制备稳定分散的四氧化三铁溶液；(2)将两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂混合形成混合液，并与步骤1)所制备的四氧化三铁溶液按照体积比3：5～10的比例混合；其中两性离子单体、交联剂、引发剂和溶剂质量范围为：两性离子单体10％～60％、交联剂0.01％～5％、引发剂0.01％～0.5％和余量溶剂；(3)将含有四氧化三铁的混合溶液进行紫外照射或者加热或常温放置，使单体通过交联聚合包埋四氧化三铁，形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。3.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤1)中，将四氧化三铁粉末分散于超纯水中之后，加入表面活性剂Span、Tween、阿拉伯胶或柠檬酸钠，使四氧化三铁均匀分散。4.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤3)中，采用模板法，将混合溶液加入到载玻片和聚四氟乙烯垫片制作的浇注模板中，进行紫外照射或常温放置或37±5℃加热放置5～60min，经过交联反应形成包埋有四氧化三铁的两性离子磁性复合水凝胶固定化酶载体。5.如权利要求2所述的方法，其特征是步骤3)中，采用微流控的方法，将含有四氧化三铁的混合溶液作为分散相，将玉米油、甘油或二氯甲烷油性溶液作为连续相；将分散相与连续相分别通过分散相与连续相进样孔通入微流控芯片；分散相进样流速和连续相进样量流速的比为1:1；微流控芯片出口连接软管，并将软管出口处连接收集管...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雷，齐海山，杜岩，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津,12