蚕电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法技术

本发明专利技术涉及一种家蚕（大造）的电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆方法。本发明专利技术的一种电压门控钠通道基因具有ＳＥＱ　ＮＯ　１所示的ＤＮＡ序列。该电压门控钠通道基因的编码蛋白具有ＳＥＱ　ＮＯ　２所示的氨基酸序列。该电压门控钠通道基因的克隆方法的具体步骤为：首先从家蚕的脑中提取总ＲＮＡ；然后用Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ　Ⅱ反转录酶和Ｏｌｉｇｏ－（ｄＴ）引物合成ｃＤＮＡ；借鉴昆虫Ｐａｒａ钠通道的保守氨基酸序列和家蚕基因组序列设计ＰＣＲ引物，采用ＰＣＲ的方法，得到各片段的克隆并测序；把各片段拼接得到家蚕钠通道基因的序列。本发明专利技术利用逆转录聚合酶链式反应（ＲＴ－ＰＣＲ）和ＰＣＲ方法，得到家蚕钠通道基因的序列和完整的开放阅读框。利用所克隆出来的核苷酸推定的编码蛋白，与其他已克隆的钠通道蛋白序列作比对，进行结构分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及鳞翅目昆虫家蚕(大造)的电压门控钠通道基因、编码蛋白及其克隆 方法。
技术介绍
电压门控钠通道(VGSC)在神经元以及其它可兴奋性细胞动作电位形成和传导 过程中扮演着极为重要的角色。当细胞膜去极化时，VGSC被电压依赖性的激活，使 胞外钠离子选择性通透进入胞内，形成动作电位的去极化相；VGSC在开放后几个毫 秒时段里就会失活，失活的VGSC需要回到静息状态后才能再开放(Catteml， 1992)。 VGSC的细微突变或变化，将影响生理功能的异常(Laietal.， 2003)。哺乳动物钠 通道基因亚型较多，如Navl.l-Navl.9和NavX，而昆虫钠通道基因的亚型相对较少， 只发现2种亚型，即；^ra基因和A9C基因。其中，仅/ ara基因编码的钠通道在体 外得以表达和功能鉴定，而ASU基因功能尚未得到鉴定(GoIdin， 2002)。目前已克 隆和测序的昆虫para直系同源钠通道基因(para-orthologous sodium channel gene)有 果蝇(Draso卢7a靴/cmogtwfer)的para基因、家蝇(她5:cci c/麵es"o )的Kssc/基因(也 称M c基因)、烟草顿虫CHeto决^ w'r^ce""的/wcp基因、德国小蠊(5/ato//a gmnam'ca)的para，基因、东亚钳蝎(5w/n^ mw加"w7)的5mWav7基因以及虎纹 捕鸟蛛(O"油o"o麵/j,函)的OZi/Vav7基因(Loughney et al" 1989; Ingles et al., 19%; Miyazaki et al., 19%; Park et al.,1999 Zuo et al.,2002)。昆虫钠通道存在于包括感 觉神经元在内的昆虫神经系统， 一般不表达在肌肉组织。细胞水平上的研究表明，昆 虫钠通道在神经元的胞体与轴突上均有表达(Wicher et al., 2001)。钠通道呈现出的亚型多样性，为理解钠通道在生理/病理下的功能特性及其动态 平衡调控带来了复杂性，同时，也正在引发通道药理与毒理基因组学研究的挑战性。 在神经系统中，各亚型的钠通道通常共表达于同一个细胞上(例如DRG神经元)，为 了阐明各亚型参与的生理活动，有必要将各通道介导的电流成分分离，但由于钠通道 各亚型介导的宏观电流性质接近，单用不同刺激方式无法获得单一电流；而体外表达 虽可以获得单一亚型的信息，但表达体系以及辅助亚基的存在与否都会对通道的性质产生重大影响，而且失去了通道在体内时的复杂环境，增加了对钠离子通道认识的难度以及应用。例如，目前临床上癫痫、神经病理性痛等的治疗药物通常以钠通道为靶 器，但由于其选择性不高，可能产生严重的副作用；昆虫钠通道是DDT和拟除虫菊 酯类杀虫剂的主要作用靶点，但长期使用和滥用会导致昆虫产生抗药性，昆虫的para 钠通道基因突变与抗药性密切相关(Williamson et al., 1996; Soderlund & Knipple， 2003)。因此，解析新型钠通道亚型的基因编码特征，不仅有利于各亚型生理功能的 阐明与药理价值的评估，同时也为钠通道关联的临床疾病治疗药物以及高效生物杀虫剂的研制提供理论的可行性和新分子先导物的开发。
技术实现思路
本专利技术的目的之一在于提供一种家蚕电压门控钠通道基因。 本专利技术的目的之二在于提供该电压门控钠通道基因的编码蛋白。 本专利技术的目的之三在于提供该电压门控钠通道基因的克隆方法。为达到上述目的，本专利技术采用如下技术方案一种家蚕电压门控钠通道基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一(1) 具有SEQ NO 1所示的DNA序列；(2) 与序列表中SEQNOl限定的核酸序列具有95%以上的同源性，且编码相 同功能蛋白质的DNA序列。一种上述的家蚕电压门控钠通道基因的编码蛋白，其特征在于该编码蛋白具有 序列表中SEQ NO 2的氨基酸残基序列或者是将SEQ NO 1的氨基酸残基序列经过 一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与SEQ NO 1的氨基酸残基序 列相同活性的由SEQ NO 1衍生的蛋白质。一种上述的家蚕电压门控钠通道基因的克隆方法，其特征在于该方法的具体步骤为a. 从家蚕的脑中提取总RNA;b. 用Superscript II反转录酶和Oligo-(dT)引物合成cDNA;c. 借鉴昆虫Para钠通道的保守氨基酸序列和家蚕基因组序列设计PCR引物，再采用PCR，得到家蚕钠通道基因和完整开放阅读框。 附图说明图1为家蚕钠通道克隆策略。图2为钠离子通道的氨基酸序列比对图。其中BomNav—家蚕；OhNavl—蜘蛛; para—果蝇；rNavl.2—鼠脑II型。具体实施方案实施例一电压门控钠通道基因的克隆1. 家蚕脑总RNA的制备用Trizol抽提家蚕组织总RNA，具体方法如下(1) 将家蚕蛹脑(约50mg)在液氮中碾磨成粉末状后，转移到一个无核酸酶的1. 5ml 离心管中；(2) 加入l ml Trizol试剂，室温下放置3分钟；(3) 加入200 Wl的三氯甲垸，剧烈振荡后，室温下放置5分钟；(4) 4。C离心(12000 rpm) 15分钟，取上清液，并转移到新的1. 5ml离心管中；(5) 加入等体积的异丙醇，约500 iil，室温放置l-2小时；(6) 4。C离心(12000 rpm) 15分钟，弃上清液，得到白色沉淀；(7) 加入l ml 75%的乙醇，清洗沉淀，略微振荡后，4'C离心(7500 rpm) 5分钟；(8) 弃乙醇，37。C放置10分钟，直到乙醇完全挥发；(9) 加入50ul Rnase-free水，溶解RNA。2. 家蚕脑cDNA的合成在无核酸酶的PCR管中加入如下物质oligo dT: l.Ou 1total RNA: l.Oug 将混合物65。C加热5分钟后，立刻冰上放置2分钟，加入如下物质dNTP (lOmM each): 2u 15 X buffer: 4ulRnasin: 1 P 1reverstranscriptase:1 u 1 加水至20ul，混匀后，置PCR仪上按如下程序反应；42 。C 90分钟99 。C 5分钟4°C 10分钟即得到逆转录的cDNA。3.钠通道基因片段的克隆根据钠通道四个保守区域的氨基酸组成，利用家蚕基因组草图，检索家蚕的同源 片段，找到三个同源克隆AADK01011234; AADK01013170; AADK01001488。借鉴昆虫 Para钠通道的保守氨基酸序列和三个同源克隆，设计克隆家蚕钠离子通道基因的PCR 引物，得到各保守片断S3, S4,S5 (PCR仪为PE-2400 (Perkin-Elmer， USA));根据 克隆到的保守序列，利用家蚕基因组中相关的三个同源克隆，设计5'端和3'端PCR 引物，用PCR的方法的到S1,S2，S6的片段，把S1到S6拼接即得到家蚕钠通道的完 整开放阅读框的序列。设计的各片断的PCR引物序列见表1。表l: PCR引物及所克隆出的片段<table>table see original document page 6</column></r本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家蚕电压门控钠通道基因，其特征在于该基因具有下列核苷酸序列之一：　（１）具有ＳＥＱ　ＮＯ　１所示的ＤＮＡ序列；　（２）与序列表中ＳＥＱ　ＮＯ　１限定的核酸序列具有９５％以上的同源性，且编码相同功能蛋白质的ＤＮＡ序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：宋红生，沈欣，孙悦，
申请(专利权)人：上海大学，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]