腈水解酶的制法制造技术

本发明专利技术提供对溴苯腈的腈基水解作用特异的腈水解酶、为该酶编码的核苷酸顺序．以及在其细胞中表达外源的腈水解酶的转化细胞．该转化细胞能表达腈水解酶以对环境进行解毒作用并保护对溴苯腈敏感的细胞免受细胞毒作用的影响．特别要使植物改良为对溴苯腈具有抗性．大肠杆菌菌株ＭＭ２９４（ｐＢｒｘ５）于１９８６年１月２２日存放于Ａ．Ｔ．Ｃ．Ｃ，并给予登记号５３４３５．（*该技术在2007年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请为1986年1月8日提出的编号为817，226的申请的部分继续申请，该申请揭示的内容在此被采用作参考。向微生物及高等有机体的细胞提供新颖的遗传特性的机会，为获得新的遗传特性开辟了一条广阔的途径。讨论的一个方面是涉及到因其细胞毒作用而被采用的许多制剂，例如，农业上所用许多化合物直接用于杀灭害虫、杂草等。在很多情况下，这些化合物具有较长的滞留时间或者持久地残留。在许多情况下，人们希望将那些欲杀死的物种与欲保留的物种区分开来。例如，人们常常想要有选择地杀死杂草而同时又对庄稼产生最少的不利影响。大部分情况下，许多除草剂都对庄稼产生相当大的不利影响，因而这些除草剂的应用基本上仅限于备急情况下使用或者次紧急情况下谨慎地使用。因而要是能够对活细胞加以改进使之产生对细胞毒制剂之类的威胁的抗性就具有很大的意义。美国专利4，535，060号描述了将草甘膦(glyphosate)抗性赋于对草甘膦敏感细胞的细菌aro A基因的应用。Hsu和Camper在Can.J.Microbiol.(1976)22卷537至543页上描述了从富含土壤的培养物分离到苯甲腈(ioxynil)降解物。Hsu和Clemson在Dissert.Abstr.Intrn.B36(1976)第8，3708，号上描述了3，5-二卤-4-羟基苯基氰一类除草剂的微生物降解作用。Ingram和Pullin在Pesticsci.(1974)第5册287至291页上描述了溴苯腈(bronoxynil)在三种类型土壤中持久性。Smith在Abstrp.MeetingWeed Soc.Am.(1971)的第16至17页上描述了溴苯腈在勒吉那(Regina)重粘土中的降解作用。Smith和Fletcher在Hort.Res.(1964)上的4册第60至62页上对3，5-二囟-4-羟苯基氰和土壤微生物进行了报导。本专利技术提供包含腈水解酶、为这些腈水解酶编码的核酸顺序，含有在一种所需要的宿主(腈水解酶基因对它来说是外来物)所识别的调节基因的转录的和转译的调节控制下为这类腈水解酶编码的基因的构成物、含有这类构成物的宿主细胞以及含有这些构成物的有机体、有机体部分或产物。已经发现溴苯腈和/或碘苯腈(ioxynil)特异的腈水解酶可用于含有溴苯腈及有关的除草剂的产地的去毒性之用，同时可保护宿主细胞免受这些除草剂的细胞毒作用。这些构成物发现可用于区分那些含有这种构成体的宿主细胞与缺乏这种构成物的宿主细胞。根据本专利技术，可以提供与囟代羟基苯并腈，特别是3，5-二溴-或3，5-二碘-4-羟基苄腈的水解有关的新颖的DNA顺序、构成物及转化了的细胞、植物以及肽。本专利技术涉及到能够水解腈的一种酶的生产，以便去除具有杀草活性的腈的毒力，并向对除草剂敏感的细胞，或宿主提供保护作用或者对含有该除草剂的环境进行解毒。这种有意义的结构基因可以从显示出能够将苯基氰作为氮源，通常将苯基氰作为唯一氮源的单细胞微生物中获得，特别是从细菌中获得。关于苄腈或腈水解酶，意思是指苄腈是一种卤代P-羟基苄腈，特别是3，5-二碘或3，5-二溴-4-羟基苄腈，腈水解酶是一种能将卤代苄腈作为氮源，特别是作为其唯一的氮源的水解酶。这种酶可以通过不同的途径获得，可以方便地从天然存在于含有溴苯腈的或磺苯腈的环境中的细菌获得。特别是肠道细菌，再进一步讲是克氏杆菌(klebsiella)种，是可获得这种酶的。肺炎克氏杆菌(klebsiella pneumoniae)，特别是变异体(klebsiella ozaenae)是可以采用的。这些细菌可以在土壤或其它苄腈的浓度越来越高的培养基中生长，而不是从土壤中分离，减少其它的可供选择的氮源直至获得可用苄腈作为唯一的氮源而生存的细菌为止。不管含有腈酶的细菌的来源如何，进行的筛选必须确保腈水解酶对苄腈的去毒作用效力。此外，这种腈水解酶应对苄腈具有特异性而不对缺少卤素的具有其他取代基的其他类似物具有特异性。因此，本专利技术的腈水解酶将是正如定义的那样是对苄腈具有特异性，对于类似物相对地是没有活性的或者活性低得多。与在可比较的浓度下以苄腈作氮源比较，在正常氮源如氨存在下，细菌的增殖率最理想的是不应显著减少，就是不少于大约10%。这一结果对于非特异性的苄腈酶是得不到的。一旦鉴定了一种以上宿主品系，那么这些技术便可用于鉴定这种腈水解酶的编码顺序。该基因可能存在于染色体或者质粒中。基因组可以被打碎，特别是用限制性内切酶将之切碎，对于基因组采用一种或者多种核酸内切酶进行内切可以提供大小从5Kb至50kb范围的片段。这些片段可以被克隆至合适的细菌(例如大肠杆菌)中的合适的载体上。对产生的转化体进行筛选以选择腈水解酶的活性，其中宿主有机体提供的环境是不利的。一旦一种或多种克隆被确认具有腈水解酶的活性，那么含有所需求的DNA片段的染色体外组成物、质粒或者病毒可以通过通常的技术，诸如宿主的溶胞作用、DNA沉降作用，以及通过将载体DNA或质粒或者病毒DNA从染色体DNA上分开的方法来进行分离。然后，染色体外组成物可以用限制性核酸内切酶来切开，用各种分离及鉴定各种不同大小片段的技术，例如，电泳、密度梯度离心法等来分离所需要的片段。根据片段的大小，通常还经进行进一步的处理以使片段大小减小到以使其更接近于该基因及其侧翼的调节区域的大小。目前已有多种技术用于处理含有为那种酶的编码顺序及其调节侧翼顺序的片段。可以采用在不同的反应混和物中用不同的限制性酶进行部分切开，然后，对这些片段进行克隆以确定哪些片段仍然保留了表达腈水解酶的能力。另一方面，该酶可以进行分离并进行部分顺序分析。根据氨基酸的顺序，可以制备用于确定具有该基因的片段的探针。通过将这种方法与限制性酶切相结合，可以对片段进行克隆和筛选以了解是否具有所需要的基因。此外，也可以用核酸外切酶，例如Bal31将片段的一端或者两端的核苷酸切除以进一步减少多余的核苷酸数目。另一方面，通过用探针筛选及通过在合适的体内或体外转译系统，如xenopus卵母细胞(Xenopus oocytes)或(reticulolysate)或者诸如此类的转译系统中进行鉴定，而该基因在合适的宿主中被克隆并使信使RNA得到分离。利用包括逆转录酶及采用DNA聚合酶形成互补链的常用技术，将分离了的信使RNA用于制备cDNA。在这例子中，所得到的结构基因缺少与转录相关的调节区域。包含这种表达腈水解酶的结构基因的DNA顺序可以被接合入很大一类其它DNA顺序中以导入合适的宿主细胞之中。互伴的顺序(companion seguence将取决于宿主的性质及该DNA顺序导入宿主的方式以及人们所期望是游离基因(episomal)处于维持的状态还是处于整合的状态。对于原核生物宿主而言，存在着很大一类载体可以通过转化作用或者接合作用、转导作用或转染作用而将DNA顺序导入原核生物宿主中。DNA顺序包括很大一类的质粒如，pBR332。pACYC184。pMB9、pRK290等等;及柯斯粒(cosmid)如，pVK100;或者病毒如;p22等等。对于真核生物宿主而言，有很多的技术可用于将DNA导入宿主，如用Ca++沉淀的DNA，包括一个非复制DNA顺序或一个质粒或小染色体，进行转化或者用一本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分子量大约为３４，０００道尔顿足够纯的细菌腈水解酶，以溴苯腈为底物，纯度至少具有比活性为０．１μｍｏｌＮＨ／分.ｍｇ蛋白。

【技术特征摘要】
US 1986-1-8 860108;US 1986-3-28 USSN845662范围内所作的某些变化改进显然也是可行的。权利要求1.一种分子量大约为34，000道尔顿足够纯的细菌腈水解酶，以溴苯腈为底物，纯度至少具有比活性为0.1μmol NH/分·mg蛋白。2.一种含有外来的可表达对于3，5-二卤-P-羟基苄腈具有特异性的腈水解酶的细菌宿主。3.一种含有分子量大约为34，000道尔顿的腈水解酶的组成物，该组成物以溴苯腈(bromoxynil)为底物，比活性至少具有大约0.1μmol NH3/分.mg蛋白。4.根据权利要求3所述的组成物，其特征在于，其中的腈水解酶为细菌腈水解酶。5.根据权利要求4所述的组成物，其特征在于，所述的细菌腈水解酶是从豆氏杆菌(Klebsiella)中得到的腈水解酶。6.根据权利要求3所述的组成物，其特征在于，所述的组成物其比活性至少具有大约为0.5NH3/分.mg蛋白。7.一种具有表达对于3，5-二卤-P-羟基苄腈具有特异性的腈水解酶的外来基团的细菌宿主。8.根据权利要求7所述的细菌宿主，其特征在于，所述的细菌宿主为大肠杆菌。9.一种包括一个能在植物细胞中起作用的调节区的转录和转译调节控制下为溴苯腈(bromoxynil)和/或碘苯腈(ioxynil)特异的腈水解酶编码的结构基因的表达盒(Cassette)。10.根据权利要求9所述的表达盒，其特征在于，其中所述的腈水解酶是细菌腈水解酶。11.根据权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：斯待卡大卫，
申请(专利权)人：罗讷布郎克农业化学公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]