多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体为多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用。本发明专利技术采用采用多巴胺在自聚合条件下包埋结合多种抗体，得到聚多巴胺和抗体修饰的SERS基底和SERS标记探针，通过免疫结合作用力，利用拉曼光谱技术实现了胰腺癌细胞提取的外泌体以及临床胰腺癌病人的血清样本的高灵敏度检测和诊断，统计学数据分析发现基于MIF抗体的SERS平台能够实现胰腺癌的肿瘤分期判断。本发明专利技术中的SERS探针标记方法简单方便，用于胰腺癌外泌体的检测，快速灵敏，特异性高，所需样本量少，无需高速离心的分离过程，能适用于临床诊断和肿瘤分期转移判断。

Various antibody labeled SERS probes and substrates and their preparation methods and Applications

The invention belongs to the field of molecular biology technology, specifically a SERS probe and substrate with multiple antibody labeling, and its preparation method and application. The invention adopts the self polymerization of dopamine in the condition of embedding combined with a variety of antibodies, and antibody obtained polydopamine modified SERS substrate and the SERS probe labeled by immune binding force, to achieve high sensitivity detection and diagnosis of serum samples of exosomes in pancreatic cancer cell extraction and clinical pancreatic cancer patients using Raman spectroscopy technique. Statistical data analysis showed that SERS staging platform MIF antibody can achieve tumor based on pancreatic cancer. The SERS probe labeling method in this invention is simple and convenient. It is used for the detection of exocrine body of pancreatic cancer. It is fast, sensitive, specific, and requires less sample size. It does not need high-speed centrifugation. It can be applied to clinical diagnosis and tumor metastasis.

【技术实现步骤摘要】
多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及多种抗体标记的SERS探针和基底及其制备方法和应用。
技术介绍
胰腺癌是预后最差的消化道恶性肿瘤之一，国家肿瘤中心对2015年全国肿瘤登记中心收集的全国各登记处上报的2012年恶性肿瘤登记资料进行分析估计，其中胰腺癌的发病例数为8.6万，发病率为6.35/105，在所有恶性肿瘤发生率中排第10位，其死亡例数达7.7万，死亡率为5.72/105，位居第6位。胰腺癌缺乏特异的临床表现和敏感的早期诊断指标，其诊断和随访常用的血清标志物是CA19-9，但诊断特异性差。目前胰腺癌术前的诊断和分期主要依赖于影像学包括螺旋CT增强扫描和磁共振成像（MRI）的表现，进行原发肿瘤大小（T）、N-区域淋巴结（N）、M-远处转移(M)的分期（TNM）判断。CT扫描时间短，成像速度快，价格便宜，但是辐射量大，不能作为常规的检查方法。MRI软组织分辨率高，能显示细节，无辐射，但是检查时间长，扫描范围的限制难以对远处转移进行评估，但最终确诊仍需病理学检查。所以目前急需开发一些快速、灵敏、特异性高、无创伤、价格适宜的胰腺癌早期诊断和分期判断的新方法和新技术。随着对肿瘤研究的不断深入，研究者发现肿瘤患者血液中存在少量循环肿瘤细胞（CTC）以及由坏死癌细胞释放的少量循环肿瘤DNA(ctDNA)。通过检测血液中的CTC和ctDNA对患者肿瘤进行诊断与监测的方法被称为液体活检（liquidbiopsy）。相对于传统的手术活检和穿刺活检方法，液体活检能够解决临床取样的难点，满足对患者高频检测的需求，并具有相比于穿刺活检副作用小、操作简单、能重复取样、成本低的优点。因此液体活检有望在肿瘤的早期筛查、肿瘤患者的动态监测和个体化用药等精准医疗方面将发挥越来越重要的作用。外泌体(exosomes)作为人体内一类重要囊泡，也开始受到越来越多的关注。由于肿瘤衍生的外泌体含有肿瘤特异性蛋白质和miRNA，在肿瘤的生长、转移中扮演者重要的角色，可以作为潜在的肿瘤诊断标志物。通过从体液，如血浆、血清和尿液中提取的外泌体，可包含肿瘤相关的信息，更易于实现对肿瘤的早期检测。研究者从胰腺癌病人血清中分离得到的外泌体中发现了一种磷脂酰肌醇聚糖-1（GPC1）糖蛋白，但是在其他良性胰腺疾病及正常人的血液中分离的外泌体中，GPC1的含量非常低。这项检测比传统的ELISA检测糖抗原CA19-9更可靠。这种基于外泌体标志物所建立的非侵入性的胰腺癌诊断方法，可以非常精确地从良性胰腺疾病中诊断出早期癌变。此外，胰腺癌外泌体中microRNA-10b的表达也升高。也有研究发现胰腺导管腺癌细胞产生的外泌体对肝转移有促进作用，且迁移抑制因子（MIF）表达显著升高。循环外泌体中的MIF可作为胰腺癌预后判断及肝转移预测的生物标志物。因此，外泌体是肿瘤研究的一个新兴领域，也是继循环肿瘤细胞CTC和ctDNA后又一备受关注的液体活检的肿瘤标志物和治疗及预后的靶点。目前对外泌体的定量表征方法主要有纳米粒子跟踪分析（NTA），电镜观察形貌，流式细胞计数法，基于外泌体表面蛋白的ELISA法或WesternBlot法，这些方法所需样本量大，灵敏度和特异性不高，样本处理复杂费时，处理通量小，无法在临床上实施，且仪器昂贵，不适合在临床推广。表面增加拉曼散射光谱（SERS）是近年来发展起来的新型表征方法和信号标记手段，具有信号强，信号稳定没有淬灭现象，易于标记，光谱信号具有“指纹”特性等优点。SERS探针的标记技术正在生物成像，疾病诊断，药物运输等生物医学领域发挥着越来越重要的作用。目前采用SERS探针标记免疫法和外泌体相关迁移抑制因子(MIF)检测胰腺癌外泌体并实现分期判断的研究还未见文献报道。我们的研究发现，双功能多巴胺修饰及保护的玻璃片及SERS探针能够高灵敏高特异性地检测到单个外泌体。因此，本专利技术设计了多种抗体（anti-MIF,anti-GPC1,anti-EGFR,anti-EpCAM）标记的SERS探针，结合多巴胺修饰的玻璃片，实现了细胞系产生的外泌体的高灵敏检测。基于anti-MIF的SERS免疫方法具有最高的灵敏度，该体系用于临床胰腺癌血清样本的诊断，统计数据结果能够显著区分胰腺癌病人及健康人的血样，并且能对胰腺癌的不同TNM的肿瘤阶段进行分类（P1,2和P3,是否转移），与病理切片的结果吻合度高。该方法仅需要2uL血清样本，无需进行高速离心，单个样本的检测时间仅花15分钟。此外，该专利技术还结合SERS成像技术，实现了高通量样本的同时成像，便于临床医生快速、准确地进行胰腺癌的临床诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提出一种用于胰腺癌外泌体的高灵敏检测的多种抗体（anti-MIF,anti-GPC1,anti-EGFR,anti-EpCAM，anti-CD9,anti-CD63）标记的SERS探针和基底及其制备方法，以及探针和基底在胰腺癌外泌体的高灵敏检测中的应用。本专利技术把anti-MIF的SERS免疫方法用于临床胰腺癌血清样本的诊断，具有最高的灵敏度和特异性性，统计数据结果能够显著区分胰腺癌病人及健康人的血样，并且能对胰腺癌的不同TNM的肿瘤阶段进行分类（P1,2和P3,是否转移），与病理切片的结果吻合度高。本专利技术提出的多种抗体标记的SERS探针和基底的制备方法，具体步骤如下：（1）在2~20mM核壳结构的金-银纳米颗粒溶液中，加入anti-MIF、anti-GPC1、anti-EGFR、anti-EpCAM、anti-CD9、anti-CD63六种抗体，每种抗体的浓度为5~40μg/mL，每种抗体的加入量为30~150μL；并加入浓度为1~20mg/mL的多巴胺溶液40~150μL；室温下反应0.5~4小时；反应后的溶液经过离心，再用去离子水进行分散；得到多种抗体标记的SERS探针；（2）取普通的玻璃载玻片泡于8~14M的NaOH中4~7h，再往溶液中添加浓度为10~100mg/ml的多巴胺溶液6~10ml，将上述培养皿放在专用摇床上摇0.5~2h，之后用去离子水冲洗干净；将修饰并清洗后的载玻片置于含有六种抗体anti-MIF、anti-GPC1、anti-EGFR、anti-EpCAM、anti-CD9、anti-CD63的体积浓度为0.2~2%的BSA（牛血清白蛋白）中，其中，每种抗体的浓度为1~10mg/mL，反应0.5~3h；用去离子水冲洗1~3次后，自然晾干，得到基片。本专利技术制备的多种抗体标记的SERS探针和基底，可用于胰腺癌外泌体的高灵敏检测，具体步骤如下。（1）细胞培养以及外泌体的提取把胰腺癌细胞系PANC-01在RPMI1640培养基中培养，培养基在使用之前添加2~20%胎牛血清、50~150μg/mL苄青霉素和50~150μg/mL链霉素，细胞置于含2~10%CO2孵箱内在25~45℃条件下培养至足够数量。采用高速离心方法提取外泌体。首先，将细胞培养液置于离心机于500~2000g（这里的g是指离心力，有时用转速来表示，但涉及到高速离心都用离心力g来表示，下同）离心2~10min，再1000~3000g离心2~10min，去除细胞碎片，取上层清液经0.22μm滤膜过滤，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多种抗体标记的SERS探针和基底的制备方法，其特征在于，具体步骤为：（1）在2~20mM核壳结构的金‑银纳米颗粒溶液中，加入anti‑MIF、anti‑GPC1、anti‑EGFR、 anti‑EpCAM、anti‑CD9、 anti‑CD63六种抗体，每种抗体的浓度为5~40μg/mL，每种抗体的加入量为30~150μL；并加入浓度为1~20mg/mL 的多巴胺溶液40~150μL；室温下反应0.5~4小时；反应后的溶液经过离心，再用去离子水进行分散；得到多种抗体标记的SERS探针：（2）取普通的玻璃载玻片泡于8~14M的NaOH中4~7h，再往溶液中添加浓度为10~100mg/ml的多巴胺溶液6~10ml，将上述培养皿放在专用摇床上摇0.5~2h，之后用去离子水冲洗干净；将修饰并清洗后的载玻片置于含有六种抗体anti‑MIF、anti‑GPC1、anti‑EGFR、anti‑EpCAM、anti‑CD9、anti‑CD63的体积浓度为0.2~2%的BSA中，其中，每种抗体的浓度为1~10mg/mL，反应0.5~3h；用去离子水冲洗1~3次后，自然晾干，得到基片。

【技术特征摘要】
1.一种多种抗体标记的SERS探针和基底的制备方法，其特征在于，具体步骤为：（1）在2~20mM核壳结构的金-银纳米颗粒溶液中，加入anti-MIF、anti-GPC1、anti-EGFR、anti-EpCAM、anti-CD9、anti-CD63六种抗体，每种抗体的浓度为5~40μg/mL，每种抗体的加入量为30~150μL；并加入浓度为1~20mg/mL的多巴胺溶液40~150μL；室温下反应0.5~4小时；反应后的溶液经过离心，再用去离子水进行分散；得到多种抗体标记的SERS探针：（2）取普通的玻璃载玻片泡于8~14M的NaOH中4~7h，再往溶液中添加浓度为10~100mg/ml的多巴胺溶液6~10ml，将上述培养皿放在专用摇床上摇0.5~2h，之后用去离子水冲洗干净；将修饰并清洗后的载玻片置于含有六种抗体anti-MIF、anti-GPC1、anti-EGFR、anti-EpCAM、anti-CD9、anti-CD63的体积浓度为0.2~2%的BSA中，其中，每种抗体的浓度为1~10mg/mL，反应0.5~3h；用去离子水冲洗1~3次后，自然晾干，得到基片。2.由权利要求1所述制备方法制备得到的多种抗体标记的SERS探针和基底。3.如权利要求2所述的多种抗体标记的SERS探针和基底在胰腺癌外泌体的高灵敏检测中的应用，具体步骤如下：（1）细胞培养以及外泌体的提取把胰腺癌细胞系PANC-01在RPMI1640培养基中培养，培养基在使用之前添加2~20%胎牛血清、50~150g/mL苄青霉素和50~150g/mL链霉素，细胞置于含2~10%CO2孵箱内在25~45℃条件下培养至足够数量；采用高速离心方法提取外泌体：首先，将细胞培养液置于离心机于500~2000g离心2~10min，再1000~3000g离心2~10min，去除细胞碎片，取上层清液...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈惠，张人，李腾达，黄志鹏，孔继烈，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31