一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用制造技术

本发明专利技术的名称是一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用，涉及微生物技术领域。它主要是解决湖北麦冬甾体皂苷受湖北麦冬“块根生产周期长”、“甾体皂苷含量低”、“皂苷提取成本高”等因素导致的市场投放量受限的问题。本发明专利技术的内生真菌分离自湖北麦冬（

【技术实现步骤摘要】
一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌及在制备甾体皂苷中的应用
本专利技术涉及微生物
，具体地是一种湖北麦冬内生真菌，该内生真菌是能够产生湖北麦冬甾体皂苷的内生青霉菌属真菌。
技术介绍
湖北麦冬甾体皂苷，是国家地理标志产品、湖北道地中药材植物——湖北麦冬Liriopespicatavar.proliferaY.T.Ma块根的主要活性成分，它的皂苷元基本骨架属于螺甾烷(Spirostane，共有27个碳原子组成)的衍生物，依照螺甾烷结构中C25的构型和环的环合状态，可将其分为螺甾烷醇类（C25为S构型）、异螺甾烷醇类（C25为R构型）、呋甾烷醇类（F环为开链衍生物）、变形螺甾烷醇类（F环为五元四氢呋喃环）四种类型。现已从湖北麦冬块根中分离出14种皂苷，其主要苷元是薯蓣苷元(Diosgenin)和鲁斯可苷元(Ruscogenin)，均为C25(S)异构体，其中以山麦冬皂苷C(Ls-S3)含量较高。研究表明：甾体皂苷具有抗心肌缺血、抗血栓形成、耐缺氧、抗衰老、降血糖等方面的药理作用，它对改善机体免疫系统、增进胃肠运动机能等方面都有着积极的影响，最新的研究表明它还具有抗肿瘤作用。尽管随着手性合成和寡糖合成方法的进展，已有一些关于湖北麦冬甾体皂苷化合物全合成的报道，但是由于甾体皂苷结构的复杂性，合成难度非常大，且化学合成对环境造成巨大的污染，目前主要还是通过分离块根提取物直接获得。但是，在湖北麦冬实际生产中，存在着诸如“连作障碍种植面积小”、“受气候条件影响较大”、“块根生产周期长”、“甾体皂苷含量低”、“皂苷提取成本高”等因素，导致湖北麦冬甾体皂苷的市场投放受到限制。目前，关于一种能够通过微生物发酵产生湖北麦冬甾体皂苷的内生真菌及其应用，还未见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种制备湖北麦冬甾体皂苷的内生真菌，内生真菌是分离自湖北省襄阳市欧庙镇湖北麦冬GAP基地生产的湖北麦冬活体块根，是通过微生物发酵产生湖北麦冬甾体皂苷的内生真菌及在制备湖北麦冬甾体皂苷中的应用。本专利技术的技术解决方案是：内生青霉菌属真菌分离自湖北麦冬（Liriopespicatavar.proliferaY.T.Ma）的活体块根，经18SrDNA序列鉴定为青霉菌属（Penicilliumsp），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年12月7日，保藏编号为CCTCCNo.M2016724。本专利技术的技术解决方案中所述的青霉菌的制备步骤是：(1)将清洗干净的湖北麦冬块根用75%(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；(2)将上述湖北麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到湖北麦冬内生青霉菌真菌(EF100)。本专利技术的技术解决方案中所述的青霉菌真菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上28℃培养，菌落圆形，最初为白色，渐变为边缘白色，中间褐色，边缘整齐。利用上述技术解决方案中所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌制备甾体皂苷是采用所述的内生青霉菌属真菌(EF100)菌株通过液体发酵制备得到甾体皂苷。上述技术解决方案中所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌制备甾体皂苷所述的液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基（PDB），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。上述技术解决方案中所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌制备甾体皂苷的制备方法包括以下步骤：(1)取所述的内生青霉菌属真菌(EF100)菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；(3)将配制好液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml75%乙醇60℃水浴1.5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层（含油脂、色素等），保留水层；(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层（含糖类等），保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得湖北麦冬甾体皂苷。本专利技术所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其18SrRNA基因序列如下：TAAGGGCAGGCACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCATACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAATTGCAATGCTCTATCCCCAGCACGACAGGGTTTAACAAGATTACCCAAACCTCTCGGTTAAGGTGATGTACTCGCTGGCCCTGTCAGTGTAGCGCGCGTGCGGCCCAGAACATCTAAGGGCATCACAGACCTGTTATTGCCGCGCACTTCCATCGGCTTGAGCCGATAGTCCCCTTAAGAAGCCAGCGGCCCGCAAATGCGGACCGGGCTATTTAAGGGCCGAGGTCTCGTTCGTTATCGCAATTAAGCAGACAAATCACTCCACCAACTAAGAACGGCCATGCACCACCATCCAAAAGATCAAGAAAGAGCTCTCAATCTGTCAATCCTTATTTTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCGTGTTGAGTCAAATTAAGCCGCAGGCTCCACGCCTTGTGGTGCCCTTCCGTCAATTTCTTTAAGTTTCAGCCTTGCGACCATACTCCCCCCAGAACCCAAAAACTTTGATTTCTCGTAAGGTGCCGAACGGGTCATTATAGAATCCCGTCCGATCCCTAGTCGGCATAGTTTATGGTTAAGACTACGACGGTATCTGATCGTCTtCGATCCCCTAACTTTCGTTcCCCTGATTAATGAAAACATCCTTGGCGAATGCTTTCGCAGTAGTTAGTCTTCAGCAAATCCAAGAATTTCACCTCTGACAGCTGAATACTGACGCCCCCGACTATCCCTATTAATCATTACGGCGGTCCTAGAAACCAACAAAATAGAACCACACGTCCTATTCTATTATTCCATGCTAATGTATTCGAGCAAAGGCCTGCTTT本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其特征在于：所述的内生青霉菌属真菌(EF100)分离自湖北麦冬（

【技术特征摘要】
1.一种湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其特征在于：所述的内生青霉菌属真菌(EF100)分离自湖北麦冬（Liriopespicatavar.proliferaY.T.Ma）的活体块根，经18SrDNA序列鉴定为青霉菌属（Penicilliumsp），已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2016年12月7日，保藏编号为CCTCCNo.M2016724。2.根据权利要求1所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其特征在于：所述的青霉菌的制备步骤是：(1)将清洗干净的湖北麦冬块根用75%(V/V)乙醇浸泡2min，用无菌水漂洗；再用有效氯含量4-6%的次氯酸钠溶液浸泡2min，最后用无菌水漂洗、蘸干；(2)将上述湖北麦冬块根在无菌条件下剪去两头褐变部分，切割成0.5cm×0.5cm组织小片，置于PDA培养基(含氨卞青霉素，终浓度为50ug/ml)上，每皿植入2片，用parafilm封口膜将培养皿密封后置于28℃恒温培养；(3)5-7天后有菌丝长出，挑取菌丝尖端转移到新的PDA培养基上纯化培养，最终得到湖北麦冬内生青霉菌真菌(EF100)。3.根据权利要求1所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其特征在于：所述的青霉菌真菌在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上28℃培养，菌落圆形，最初为白色，渐变为边缘白色，中间褐色，边缘整齐。4.一种利用权利要求1所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：采用所述的内生青霉菌属真菌(EF100)菌株通过液体发酵制备得到甾体皂苷。5.根据权利要求4所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于：所述的液体发酵的培养基是马铃薯液体培养基（PDB），所述的液体发酵培养基的配方是：200g土豆，20g葡萄糖，1000ml蒸馏水。6.根据权利要求4或5所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌在制备甾体皂苷中的应用，其特征在于，所述的甾体皂苷的制备方法包括以下步骤：(1)取所述的内生青霉菌属真菌(EF100)菌株菌种，在无菌条件下，用接种针挑取少量菌丝，接入已灭菌的PDA培养基试管，于28℃活化培养72小时；(2)取活化培养后的菌种，在无菌条件下，转接入已灭菌的液体马铃薯种子培养基中，28℃下180rpm振荡培养72小时，得种子；(3)将配制好液体发酵培养基分别装入250ml的三角瓶中，每瓶约100ml，灭菌处理，冷却备用；无菌条件下，按照10%的接种量接入种子，28℃下180rpm振荡培养7天；(4)发酵完毕，将发酵固液混合物置于超低温冰箱中快速冷冻成固态后，使用小型冷冻干燥机进行低温冷冻干燥处理，得到干燥的发酵产物，研磨粉碎；(5)将发酵粉碎物转入锥形瓶中，加入100ml75%乙醇60℃水浴1.5小时后，过滤，得滤液；同时，滤渣再加入100ml的75%乙醇，继续水浴1.5小时后再次过滤，合并2次滤液；(6)对滤液采用减压浓缩方法，去除乙醇，得到浸膏，加入100ml纯水溶解；(7)将上述浸膏水溶液转入分液漏斗中，加入40ml乙醚进行充分萃取，去除乙醚层（含油脂、色素等），保留水层；(8)将水层溶解物转至新的分液漏斗中，加入100ml水饱和正丁醇进行充分萃取，去除水层（含糖类等），保留正丁醇层，减压浓缩去除正丁醇后，得浸膏，加入甲醇复溶得湖北麦冬甾体皂苷。7.根据权利要求1所述的湖北麦冬内生青霉菌属真菌，其特征在于：所述的内生青霉菌属真菌18SrRNA基因序列如下：TAAGGGCAGGCACGTAATCGGCACGAGCTGATGACTCGTGCCATACTAGGCATTCCTCGTTGAAGAGCAATAAT...

【专利技术属性】
技术研发人员：余海忠，叶国栋，潘婉莲，黄立明，
申请(专利权)人：湖北文理学院，
类型：发明
国别省市：湖北,42