本文介绍了一种衍生出能产生印苦楝子素的细胞的植物细胞悬浮培养法，该培养法克服了现有的种子提取法存在的缺点。该方法能连续生产无致病源和毒素的印苦楝子素，并不受环境条件限制。它能生产产量和质量均可预测的生物活性产品并能在所需的容器内连续生产。（*该技术在2013年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术系有关植物激素非依赖性细胞培养法，具体说来，本专利技术关系到生产生物活性化合物时植物细胞培养法的应用。本专利技术特别关系到产生杀昆虫四降三萜系印苦楝子素的植物细胞培养物以及从该细胞培养法获得印苦楝子素的方法。生物活性化合物的工业规模产量，可以在大到100，000立升的生物反应器中生长培养细胞来达到(Payne，et al.(1992)Plant Cell Culture and Tissue Culture in Liquid Systems，Oxford University Press，New York;Scragg AH(1990);Fermentztion systems for plant cells INCharlwood，BV and MJC Rhodes，Eds Secondary Products from Plant Tissue Culture，Oxford，University Press，New York).但却鲜有工业规模生产次级代谢产物的植物细胞培养物的例子。这是因为一般来说，通过植物细胞培养来获得所需化合物比从天然产物提取植物部分更为昂贵。目前植物细胞培养的成本超过细菌和酵母发酵的成本。US 4717664(1988年1月5日公开的生产植物二级代谢产物的方法)公开了从某些植物家族的悬浮培养液中获得次级代谢产物的两步法。为使所需二级代谢产物产量达最大，至少使用二阶段液体培养基，即生长培养基和生产培养基。生产培养基的至少一种成份基本上不同于生长培养基。根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)是借助称之为“转化”的方法，介导基因物质向易感植物细胞的染色体DNA转移的一种植物致病细菌。通过介导编码植物激素的基因进入植物染色体DNA，转化作用便改变了植物次级代谢。因此，这些瘤细胞能在无外加植物激素的条件下于培养中生长。Zambryski等人(1989，Cell 56∶193-202)曾介绍过，当土壤杆菌感染植物细胞时，出现的分子基因物质的序列。该作者还公开了新出现的对植物染色体DNA的基因修饰，以及被转化的植物细胞的瘤生长特征。Saito等人(1992，J.Nat Prod (LLoydia)55(149-162)讨论过土壤杆菌介导基因转移作为在突变医用植物中增长次级代谢产物的策略。Saito等人公开来自冠五倍子瘤的悬浮细胞被用于生产某些特异性次级代谢物，特别是喹啉生物碱和异类黄酮葡糖苷。Berlin等人(1989，Planta Medica 55∶685)公开了使用根癌土壤杆菌转化Lupinus细胞培养物以改变次级代谢途径，并作出正常培养物与转化培养物之间生产能力的定量比较。Berlin等人公开非转化和转化悬浮培养液产生同样的化合物谱，而转化细胞比非转化细胞系生产高至10倍的异类黄酮二葡糖苷。然而作者也公开当将这些细胞老化(变得非常凸凹不平)时，与转化细胞新观察到的产量相比，非转化细胞中异黄酮的产量升高。Berlin等人进一步指出，转化悬浮物中加入植物激素不增加异黄酮产量。Cosio等人(1986，J.Plant Physiol 124∶155)揭示通过用根癌土壤杆菌转化细胞合成硫代红荧烯(thiarubrine)受细胞的组织程度影响而非作为细胞转化的直接结果。Norton等人(1985，Phytochemistry 24∶719)报道以上根癌土壤杆菌转化的靶细胞中产生硫酚，并得出结论，由来自感染植物的基因物质转移进冠五信子然后转移到已转化胼胝体组织的结果所产生的次级代谢物的量是不可予测的。Eilert等人(1987，Plant Cell Reports，6∶271)报道用根癌土壤杆菌转化Catharanthus roseus细胞与常规的非转化细胞相比，其生物碱文多林的积累并不增加。此外，转化细胞对以Pythium匀浆的激发作用无反应。Tremouillaux-Guiller等人(1988，Plant Cell Reports，7∶456)检测Choisya ternata组织培养物产生的生物碱，发现21个转化细胞培养物与非转化细胞培养物比较，转化细胞表现出巴福定鎓(balfourodinium)产量较低，而转化与非转化系之间platydesminium却没有差别。已知土壤杆菌属根瘤菌可用来产生转化根培养物，已转化根可在无激素培养基中生长，并且一般产生与在非转化的分化根组织中所见的相同的次级化合物(MJC Rhodes等人，1990，INCharlwood，BV and MJC Rhodes，Ed.，Secondary Products from Plant Tissue Culture.Oxford University Press，New York)。 本
称之为“激动剂”的化合物可用来增加某些次级代谢物产生，激动剂可以是刺激某些植物次级代谢物从头合成使其很快增加的生物或非生物化合物。激动剂的例子包括粗制真菌提取物、金属离子、碳水化合物和蛋白质(Clcapter 11，Pg 333 INPayne等人Plant Cell and Tissue Culture in Liquid Systems，Oxford University Press，Ny，1992)。Kurz公开了使用半连续培养法重复加入激动剂到细胞悬浮液中(1987，IN∶T.Mabry，Ed.Plant Biotechnology Research Bottlenecks for Commercialization andBeyond，IC2Institute，Austin，TX;Questions and Strategies for Productivity improvement).Van der Heijden等人(1988，Plant Cell Reports，7∶51)公开了使用激动剂诱导某些Tabernaemontana品种中抗微生物三萜的从头合成。该研究集中于是否这些抗微生物三萜是植物防御素。EP-A-0378921(Crawford等人)揭示检测培养细胞生理状态的方法，以便为增加次级代谢产物，激动剂于最佳时间施用，该时间为生长期结束时。该专利也公开了在激发时间加入细胞生存稳定剂和/或营养物。Melieae家族成员已知含生物活性化合物，具体说来，从neem树Azadirachta indica A.Juss(与Melia azadirach同义)获得的化合物被用于许多产品中，包括肥皂，牙膏、化妆品，药物、消毒剂、肥料及杀虫剂。(Jacobson M(1986)，Am.Chem.Soc.Symp.Ser.，296∶220-232;Schmutterer，H.and K.R.S.Ascher(1987)，Natural Pesticides from the Neem Tree(Azadirachta indica A.Juss)and other tropical p本文档来自技高网...
【技术保护点】
生产印苦楝子素的方法，包括：ａ. 以根癌土壤杆菌在细胞培养基中接种印苦楝子ｉｎｄｉｃａ组织产生印苦楝子胼胝细胞培养物，ｂ. 将来自胼胝细胞培养物的胼胝细胞接种进水培养基中，形成含细胞和培养基的悬浮细胞培养物，ｃ. 维持该悬浮细胞培养物 以使由此产生印苦楝子素，及ｄ. 从悬浮细胞培养物中回收印苦楝子素。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：LP霍罗瓦奇凯勒，I比尔曼，DR帕特森，
申请(专利权)人：罗姆和哈斯公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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