蛋白质的分离制造技术

一种从含水蛋白质混合物中分离蛋白质的方法包括： ａ）提供一种盐浓度为或低于１．５Ｍ的含水蛋白质混合物，水溶性聚合物已被加入到此混合物中； ｂ）回收晶体形式的蛋白质。（*该技术在2014年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从蛋白质水溶液中分离蛋白质，尤其是酶的方法，及回收晶体形式的期望蛋白质。酶通常以液体或非晶体材料用于工业目的。如不用液体，一般用非晶体材料，因为通常认为酶晶体化的已知方法太昂贵以致不能用于工业化规模。由于酶晶体的高纯度，提供一种容易适合于工业化规模的酶的晶体化的廉价和简便的方法显然是工业上的需要。关于酶的晶体化的文献很多。难于概括关于具体晶体化方法的结果。酶晶体化的技术是高度经验主义的，而且对一组酶证实是成功的方法，对其它酶不一定是成功的。迄今已知的蛋白质晶体化方法的特性是很纯和很浓的初始浓度，低产率、很长的结晶时间、高的化学品包括有机溶剂的消耗，和差的工业适用性。本专利技术的目的是提供一种回收晶体蛋白质尤其是酶的方法，此方法不需要加入大量的盐或有机溶剂，允许短的结晶时间和高的产率，并且简单、价廉及适于工业要求。因此，本专利技术提供了一种从蛋白质含水混合物中分离蛋白质的方法，此方法包括a)提供一种盐浓度为1.5M或低于1.5M，其中加入了水溶性聚合物的蛋白质含水混合物；b)回收晶体形式的蛋白质。本专利技术通过附图得以进一步说明，其中，附图说明图1说明在不同的PEG4000浓度和不同的CaCl2浓度(■1％CaCl2；▲2％CaCl2，□2.5％CaCl2)下过氧化物酶的晶体化产率(％)。图2说明在不同的pH值条件下过氧化物酶的晶体化产率(％)。图3说明在不同的酶和PEG 4000的浓度下(■3％过氧化物酶和1.4％的其它酶；◆4.8％过氧化物酶和2.3％的其它酶，及▲6.7％的过氧化物酶和3.1％的其它酶)过氧化物酶晶体比产率(％)。图4说明在不同的CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度下(■20％PEG 4000；◆22％PEG4000；▲24％PEG4000；□26％PEG4000；◇28％PEG4000和△30％PEG4000)过氧化氢酶的晶体化产率(％)。图5说明在不同的CaCl2浓度和不同的PEG 4000浓度下(■20％PEG 4000和◆25％PEG 4000)过氧化氢酶的晶体化产率(％)。图6说明在不同的PEG1500浓度和0.2％的CaCl2浓度下过氧化氢酶的晶体化产率(％)。图7说明在不同的PEG 4000浓度下蛋白酶的晶体化产率(％)。图8说明在不同的PEG 4000浓度和1.1％的CaCl2浓度下蛋白酶的晶体化产率(％)。本专利技术提供了一种从含水混合物中分离蛋白质或多肽的方法，此混合物包括具有不同结晶特性的其它蛋白质。令人惊奇地发现，通过加入水溶性的聚合物，例如聚乙二醇，可从其混合物中分离蛋白质，此混合物含其它蛋白质和其它杂质，如碳水化合物，并且蛋白质能够以晶体形式析出。用聚乙二醇(PEG)沉淀和结晶蛋白质及用PEG修饰晶体结构可从文献中获知，然而用PEG结晶纯化蛋白质是新的。PEG已单独用于获得衍射分析的晶体，参见A.Mcpherson in Eur.J.Biochem.189，1990，pp.1—23；R.N.Haire et al.in Biopolymers Vol.23(12)，1984，pp.2761—2779；and J.C.Lee et a1.in J.Biol.Chem.256(2)，1981，pp.625—631。一般认为，PEG借此发挥作用的部分机制，象用盐和有机溶剂诱导的结晶一样，结合降低溶液的等电特性，进行盐析作用。除此之外，在某些情况下，PEG似乎能通过增加蛋白质的热力学活性使蛋白质从溶液中析出，结果产生一种非结晶的PEG次级相，非结晶的蛋白质沉淀能从此次级相有效地转变成蛋白质晶体，参见K.N.Haire et al.in Biopolymers Vol.23(12)，1984，pp.2761一2779。通过使用PEG和高盐浓度，另一种用于蛋白质结晶的PEG含水双相体系已经产生，其中用PEG相浓缩了蛋白质，在界面处晶核产生了，在高盐浓度的驱动下在水相中生成了晶体，参见Eur.J.Biochem.189.1990.PP.123。根据本专利技术的研究，一种不同的令人惊奇的机理似乎解释了结晶过程，基本的差别是在相当低的盐浓度下，通过PEG分子和蛋白质之间的亲和力动结晶。其结果是相分离在此蛋白质以水溶性形式浓缩成微滴，其中如下所述晶核和晶体产生了当将PEG(以自身不产生双相体系的浓度)加至蛋白质溶液中时，对PEG具有亲和力的蛋白质与PEG分子缔合产生非均质溶液，在恰当的PEG分子量、PEG浓渡、盐浓度和蛋白质浓度下，非均质溶液能产生一种体系，此体系含有降低了的蛋白质浓度的水相和很高蛋白质浓度的微滴。此体系似乎和正常的含水双相体系完全不同，因为不能通过传统低速离心分开相；但是，用超速离心(如实施例11所述)，可能看到两相。在具有高蛋白质浓度和可除去一些杂质的小滴中，产生了晶体形成的最适条件。晶体此时显然在小滴中形成，直至它们达到一定大小，它们可以崩出小滴产生一种正常的单相含水体系，此体系在结晶完毕含有固态晶体。然而，依赖于要探究的蛋白质，此体系也能以双相体系终止，在小滴相中的带有大部分晶体。出现在小滴相中和从周围浓液小滴表面崩出的晶体生长的实例也已被观察到。在一双相含蛋白质的小滴体系中通过纯化和浓缩的形式结晶蛋白质的这种假定机制通过在水溶性聚合物和蛋白质之间的亲和力而产生，证实此技术甚至对低浓度和不纯蛋白质溶液也是非常有利的。本专利技术的方法可用于从蛋白质混合物中分离蛋白质，特别是从蛋白质的混合物中分离酶。在优选的实施例中，含酶溶液是通过培养产酶的微生物获取的培养肉汤。优选地本专利技术的方法用于培养肉汤，此肉汤首先接受固/液分离技术，例如经絮状沉淀、离心、过滤或微过滤处理。在结晶前经沉淀或用层析方法纯化也可能是有用的。在更具体的实施例中，本专利技术的方法包括通过本身已知的方法浓缩合酶溶液。此方法包括经超速离心、透析过滤、透析或蒸发浓缩。含蛋白质的水溶液的浓缩，虽然对进行结晶不必要，但是便于操作和产生理想产率。由于实际原因，含酶溶液可被浓缩至酶蛋白的含量为0.1—25％W/W，优选0.5—15％W/W，最优选1—10％W/W。在优选的实施例中，本方法用于分离氧化还原酶、蛋白酶、脂酶、淀粉酶和纤维素酶。氧化还原酶已在“Enzyme Nomenclature 1992，Academic Press，Inc.，San Diego”，中定义并叙述过，属于一类催化电子从一种物质变成另一种物质(氧化—还原)的酶。氧化还原酶包括脱氢酶、还原酶、氧化酶、转氢酶、过氧化氢酶、过氧化物酶和加氧酶。更具体的实例包括辣根过氧化物酶、木质素酶和其它过氧化物酶，和如漆酶的氧化酶。这些酶优选地来源于微生物。可用于产生合适的氧化还原酶的微生物属的实例为栓菌属((Trametes)、丝核菌属(Rhizoctonia)假单胞菌属(Pseudomonas)芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomvces)，蜡伞属(Hygrophorus)、鬼伞属(Coprinus)、多孔菌属(Polyporus)、假丝酵母属(Candida)、变孢属(Curvularia)、尾孢属(Cercospora)、Mycoliophtora、曲霉属(As-pergillus)、和Scytali本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：B·M·尼尔森，M·A·劳斯特森，A·兰克马德森，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：