克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌的构建方法技术

本发明专利技术涉及克隆有鲑鱼降钙素（ＳＣＴ）基因的变铅青链霉菌的构建方法。本发明专利技术采用基因工程技术，以质粒Ｐ↑［ＩＪ６８０］为载体。其中包括采用ＰＣＲ（多聚酶反应）扩增技术，分别扩增获得鲑鱼降钙素（ＳＣＴ）基因和分泌信号肽ｍｅｌｃ↓［１］基因；通过Ｔ↑［４］ＤＮＡ连接酶将ＳＣＴ基因、ｍｅｌｃ↓［１］、基因和Ｐ↑［ＵＣ１９］质粒ＤＮＡ连接，转化至大肠杆菌制备获得ＳＣＴ－ｍｅｌｃ↓［１］ＤＮＡ片段；该片段与链霉菌载体质粒Ｐ↑［ＩＪ６８０］连接后，通过转化使其克隆至变铅青链霉菌ＴＫ５４，挑选抗硫链丝菌素的转化子，提取重组质粒，得到重组质粒Ｐ↑［ＭＳ６８０］，获得了克隆有鲑鱼降钙素基因的变铅青链霉菌ＴＫ５４－ＭＳ６８０，（含有重组质粒Ｐ↑［ＭＳ６８０］），将该克隆菌株进行发酵培养，即可获得高效分泌表达的鲑鱼降钙素，本工程菌遗传性稳定。（*该技术在2016年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

【技术保护点】
克隆鲑鱼降钙素（ＳＣＴ）基因的变铅青链霉菌的构建方法，其中包括ＰＣＲ扩增；两个连接步骤；转化；挑选转化子，提取重组质粒和经确证后得到所需菌种五个步骤；其特征在于：（１）ＰＣＲ扩增：根据已知鲑鱼降钙素基因核苷酸序列设计引物Ｐ１和Ｐ２，以鲑 鱼ＤＮＡ为模板，扩增获得鲑鱼降钙素基因，扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为９０－９５℃变性１－３分，４０－４５℃退火１－２分，７０－７５℃延伸１－２分；后二十五次循环为：９０－９５℃变性１－３分，５０－５５℃退火１－３分，７０－７５℃延伸１－２分。最后在７０－７５℃延伸８－１５分；根据分泌信号肽ｍｅｌｃ↓［１］，核苷酸序列设计了引物Ｐ３和Ｐ４，以Ｐ↑［ＩＪ７０２］ＤＮＡ为模板，扩增获得了分泌信号肽ｍｅｌｃ↓［１］编码基因；扩增反应采取两步不同条件循环方式，前五次循环为９０－９５℃变性１－３分，３０－４０℃退火１－３分，７０－７５℃延伸１－２分，后二十五次循环为：９０－９５℃变性１－３分，４０－４５℃退火１－２分，７０－７５℃延伸１－２分，最后在７０－７５℃延伸８－１５分；（２）ＳＣＴ－ｍｅｌｃ↓ ［１］ＤＮＡ片段的连接ＰＣＲ扩增后获得的１１７ｂＰ ＤＮＡ片段（经序列分析确证为ＳＣＴ编码基因），用限制性内切酶ＰｓｔＩ和ＢａｍＨＩ酶切；ＰＣＲ扩增后获得的３７０ ｂＰ ｍｅｌｃ↓［１］编码基因（经序列分析确证为ｍｅｌｃ↓［１］编码基因 ）以ＢｃｌＩ和ＰｓｔＩ进行酶切；以ＥＣｏＲＩ－ＢａｍＨＩ酶切Ｐ↑［ｕｃ１９］质粒，以３－５∶３－５∶１－２浓度比，在加入Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶后进行连接，按Ｓａｍｂｒｏｏｋ等人方法将连接的ＤＮＡ转化至大肠杆菌ＪＭ１０９，在含有５０－１００微克氨苄青霉和Ｘ－ｇａｌ，ＩＰＴＧ的琼脂平板上，从白色菌落挑选转化子，提取重组质粒Ｐ↑［ＵＣ１０９－ｍｅｌ－ＳＣＴ］，经ＳａＣＩ－ＸｂａＩ双酶切，获得一定数量的ｍｅｌｃ↓［１］－ＳＣＴＤＮＡ片段。（３）ＳＣＴ－ｍｅｌｃ↓［１］ ＤＮＡ片段 与链霉菌载体Ｐ↑［ＩＪ６８０］的连接；将上述ＳＣＴ－ｍｅｌｃ↓［１］ ＤＮＡ片段与ＳａＣＩ－ＸｂａＩ酶切的链霉菌载体质粒Ｐ↑［ＩＪ６８０］以３－５∶１的浓度比例在Ｔ↓［４］ＤＮＡ连接酶切作用下，按常规方法进行连接；（４）转化：采用（ ３）步骤中连接的重组ＤＮＡ，以变铅青链霉菌ＴＫ５４的原生质体为受体，按照Ｈｏｐｗｏｏｄ等报道的方法，将连接的ＤＮＡ转化至该受体...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李元，洪斌，李嗣英，陈松森，刘伯英，郭强，王醒，郭连宏，高萍，
申请(专利权)人：中国医学科学院医药生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]