一种结直肠癌易感基因的筛查方法技术

本发明专利技术公开了一种快速准确且能够覆盖最新的结直肠癌易感基因的所有外显子区域的结直肠癌易感基因的筛查方法。本发明专利技术的基本方案是从个体中抽取3‑5ml的血液，从血液中提取3‑5μg gDNA,并利用超声将其打断、扩增，从而构建人的全基因组文库，然后利用本发明专利技术的结直肠癌易感基因扫描试剂盒对乳腺癌易感基因进行捕获，然后利用新一代测序仪进行高通量测序，分析找出这些基因相关的突变信息，以达到结直肠癌易感基因筛查的目的。

【技术实现步骤摘要】
一种结直肠癌易感基因的筛查方法
本专利技术涉及一种基因的筛查方法，尤其是一种结直肠癌易感基因的筛查方法。技术背景大肠癌（结、直肠癌）是发生在大肠的恶性肿瘤，在西方发达国家，其发病率居恶性肿瘤谱的第二位。在我国，每年结直肠癌新发病例达13-16万，发病率每年以4.2%的速度在增长，已跃居癌症死亡第三-五位。结直肠癌按照组织学分型可分为腺癌、粘液癌和未分化癌。其中，腺癌占结直肠癌的四分之三，按分化程度可分为三级。未分化癌分化程度最低，恶性程度最高。结直肠癌的具体症状因分型的不同而表现各异。大肠癌是多因素、内外因交互作用的，多阶段发生发展的疾病。大肠癌发病过程可从黏膜增生到腺瘤癌变和侵润的阶段性演进，可长达十余年。根据目前外科技术和放化疗条件，大肠癌完全可以争取到更好的治疗效果。但事实上，临床上所见Ⅰ期结直肠癌术后5年生存率仅10%左右，更不用说中晚期病人。在治疗上，公认的大肠癌以手术为主，但由于手术方案尚未统一、围手术期的辅助治疗尚未规范等，误诊和漏诊现象及其严重，使很多患者错过了最佳的治疗方案。大肠癌中大约1/3的具有遗传背景，为一组遗传易感人群。其中，家族性腺瘤性息肉病（familialadenomatouspolyposis）和遗传性非息肉病性结直肠癌（hereditarynonpolyposiscolorectalcancer）是最常见的遗传性大肠癌。《NCCN指南》提出：所有的大肠癌患者都应该询问家族史，疑似遗传性大肠癌患者应当进行相应遗传学检测，做到早发现早预防。建立系统、科学的结直肠癌易感基因模型是未来结直肠瘤预防和治疗的发展方向。随着基因基因组学的迅猛发展，使针对遗传性(携带突变基因)和家族性结直肠癌人群进行肿瘤易感基因筛查成为可能，从而有效预防结直肠癌的发生，做到及早干预和预防，并大大降低其发生率和死亡率。目前已知的结直肠癌易感基因有APC、DCC、TP53和ATM等。APC基因(腺瘤性息肉病基因)是一个抑癌基因，在许多组织中均有表达，起调节细胞生长和自身稳定的作用。它直接参与了Wnt的信号传导途径，正常APC蛋白与Axin、GsK-3β形成复合物保证Wnt信号途径对细胞分化、增殖、极性以及迁移的正常调节。APC基因的突变可导致细胞重要信号的异常，从而导致癌变。APC基因在85％的结肠癌中缺失或失活，该基因的缺失与结肠癌的遗传易感性密切相关。DCC(结直肠癌缺失基因)是一个重要的抑癌基因，氨基酸顺序与神经细胞粘附分子（N-CAM）及其它相关的细胞表面糖蛋白十分相似。DCC基因抑癌作用可能与其诱导细胞凋亡有关，当DCC基因通过正常表达，阻止其指导合成的受体蛋白质与神经轴突导向分子netrin-1结合，相关细胞就会受到诱导死亡信号，随后该细胞逐渐凋亡。但如果DCC基因无法正常表达，导致上述受体蛋白质与神经轴突导向分子相互结合，有关细胞就会继续存活，甚至异常增殖。Tp53是一种肿瘤抑制基因(tumorsuppressorgene)。在所有恶性肿瘤中，50%以上会出现该基因的突变。由这种基因编码的蛋白质(protein)是一种转录因子(transcriptionalfactor)，控制着细胞周期的启动。p53基因在正常情况下对细胞分裂起着减慢或监视的作用。细胞中抑制癌变的基因"p53"会判断DNA变异的程度，如果变异较小，这种基因就促使细胞自我修复，若DNA变异较大，"p53"就诱导细胞凋亡。一旦突变，会失去对细胞分裂的控制而发生癌变。近年来，基因组测序技术发展迅速，并已经逐渐应用到临床肿瘤研究领域。新一代高通量测序技术（NGS）不仅通量大、速度快、灵敏度高，而且大大降低了成本，是目前最先进的基因测序手段。本专利技术的目的是提供一种快速准确且能够覆盖结直肠癌易感基因的诊断方法。本专利技术的基本方案是从血液中提取基因组DNA(gDNA)，然后超声打断，构建基因组文库，然后进行结直肠癌易感基因捕获，利用新一代测序仪进行高通量测序，经过SNPs等分析，得到个体内结直肠癌易感基因的变异情况。
技术实现思路
本专利技术提供一种准确度高、预测性好的感基因筛查方法。实现本专利技术目的的一种结直肠癌易感基因的筛查方法，包括如下步骤:(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列。常见结直肠癌易感基因列表如下：调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域;(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物素标记的探针，并制作结直肠癌易感基因高通量扫描试剂盒;所述试剂盒检测方法包括如下步骤:从正常人血液中提取3-5μg基因组DNA，利用超声打断，扩增，构建人的全基因组文库，然后利用结直肠癌易感基因扫描试剂盒将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出结直肠癌易感基因的所有信息，以达到对结直肠癌易感基因筛查的目的。利用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程、插入缺失标记分析(InDel分析)和大片段扩增缺失分析流程;所述单核苷酸多态性分析(SNP分析)过程包括如下步骤:(1)测序仪(IlluminaNextseq500)获取原始短序列并去除测序数据中的接头;(2)用TrimGalore进行QC并去除低质量数据;(3)把短序列用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(4)用GATK软件找出序列中所含有的单核苷酸多态性(SNP)的信息;(5)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等，过滤低质量值(大于25)和低覆盖度(大于10)的单核苷酸;(6)利用ANNOVAR3、人类基因组数据库(HOMO_SAPIENS_NCBI_BUILD37.2)、dbSNP、COSMIC68信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能(错义突变/无义突变/可变剪切位点)、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测;(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸。同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸;所述插入缺失标记分析(InDel分析)流程包括如下步骤:(1)把去除接头序列和低质量的测序数据用BWA-Burrows-WheelerAlignment(BWA)软件定位到人类基因组数据相应的位置上(所用到参数:bwaaln-L-l40-i10-k2-t7-e40-M3-f);(2)用Pinel软件找出序列中所含有的括入/缺失(InDel)的信息(所用到参数:Pindel-k-H50-w10-E0.6-a8-M10-m1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种结直肠癌易感基因的筛查方法，包括制作结直肠癌易感基因扫描试剂盒的方法和试剂盒筛查方法。

【技术特征摘要】
1.一种结直肠癌易感基因的筛查方法，包括制作结直肠癌易感基因扫描试剂盒的方法和试剂盒筛查方法。2.结直肠癌易感基因扫描试剂盒的方法包括如下步骤：(1)根据人类基因组HG19，调取如下基因的外显子序列，常见结直肠癌易感基因列表如下：调取外显子的序列包含列表基因的基因区域，以及己知各个转录本的启动子区域;(2)对每个区域中非重复区域设计120bp的探针序列，每个序列沿着基因位置挪动设计，探针之间的挪动大小60bp;(3)采用原位合成技术，在芯片上大量合成设计的探针，并利用多聚酶链式反应或转录的方法扩增出大量的带有生物术标记的探针，并制作结直肠癌易感基因扫描试剂盒;所述试剂盒筛查方法包括如下步骤:从正常人血液中提取基因组DNA，超声打断，构建基因组文库，然后利用结直肠癌易感基因探针将目的基因序列捕获出来，再用测序仪(IlluminaNextseq500)进行高通量测序，进而分析，找出结直肠癌易感基因的所有突变信息，以达到结直肠癌易感基因筛查的目的。3.根据权利要求2所述的一种结直肠癌易感基因的筛查方法，其特征在于：分析样本采用血液中基因组DNA，采用测序仪进行高通量测序，分析的过程包括单核苷酸多态性分析过程、所述括入缺失标记分析流程和大片段扩增确实分析流程;所述单核苷酸多态性分析过程包括如下步骤:(1)测序仪获取原始短序列;(2)去除测序数据中的接头和低质量数据;(3)把短序列定位到人类基因组数据相应的位置上;(4)统计测序结果信息，短序列数量、目标区域覆盖大小、平均测序深度等;(5)过滤低质量值和低覆盖度的单核苷酸;(6)利用CCDS、人类基因组数据库、dbSNP信息对单核苷酸进行注释，确定突变位点发生的基因、坐标、mRNA位点、氨基酸改变、单核苷酸功能、SIFT预测单核苷酸影响蛋白功能预测;(7)根据疾病样品和正常样品信息，选出疾病样品所共有的而在正常组中不存在的单核苷酸作为候选的单核苷酸，在候选的单核苷酸中去除掉在dbSNP、HAPMAP、1000人类基因组、其他外显子测序项目中出现的单核苷酸；同时，过滤掉SIFT预测对蛋白功能无影响的单核苷酸作为最后疾病相关的候选单核苷酸;所述括入缺...

【专利技术属性】
技术研发人员：张道允，巩子英，叶建伟，王伟，
申请(专利权)人：嘉兴允英医学检验有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江,33