基因工程腺病毒及其用途制造技术

本发明专利技术构建了两种基因工程腺病毒，它们能选择性地在ｐ５３功能缺失的人肿瘤细胞中大量复制，并最终杀死肿瘤细胞。同时，它们并不能在正常细胞中复制。其抗肿瘤的疗效是通过检测小鼠身上的人肿瘤移植模型进行确证。试验数据表明，此工程腺病毒可用于治疗特定的肿瘤模型。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因工程腺病毒，它们能选择性地在p53功能缺失的肿瘤细胞中大量复制并最终杀死肿瘤细胞，但它们并不能在正常细胞中复制。此外，本专利技术还涉及含有该基因工程腺病毒的药物组合物以及该基因工程腺病毒在制备用于治疗癌症的药物组合物中的用途。癌症是一种异源性疾病的总称，其特征为非正常细胞的无限生长和增殖。通常认为，正常细胞的增殖受两种相互拮抗的基因的调节，即原癌基因和肿瘤抑制基因。原癌基因能促进细胞的生长，而肿瘤抑制基因则抑制细胞的生长。当基因发生突变，即原癌基因被激活或肿瘤抑制基因失活，均可加速肿瘤细胞的生长。通常肿瘤抑制基因(包括p53，RB基因)的失活和原癌基因的激活同时发生，其结果是产生无限增殖的肿瘤细胞。尽管不同类型的基因变化都有可能导致细胞生长调节基因的功能发生变化，并产生非正常的细胞增殖。通常认为需要多种因素同时作用才能将正常细胞转化成为肿瘤细胞。其精确的分子途径和随之发生的细胞变化导致细胞恶性增殖的机理尚未明了。但已有许多报道表明，细胞内的一些蛋白在细胞增殖周期的调控中起着重要作用，当它们的功能发生变化时，往往会导致细胞的恶性转化，例如当p53基因产物失活时，会使细胞的生长失去控制。尽管已经有了许多发现，但目前癌症的治疗绝大部分仍用常规的治疗方法，如放疗和化疗。这些方法的治疗指数很低，而且副作用很大，常给病人带来很多痛苦，甚至生命受到威胁，如骨髓的抑制等。近年来，已经有科学家应用基因治疗的方法来修正或补充人等位基因的缺陷，用于治疗一些遗传性疾病，但目前为止成功率较小。其主要采用的方法是将一段寡核苷酸序列转导入人细胞中，以期表达正常的功能蛋白，纠正等位基因的缺陷或补偿细胞的某种功能。应用的载体是复制缺陷型重组腺病毒。如将肿瘤坏死因子(TNF)和白介素II(IL-2)导入细胞内进行肿瘤治疗。在美国专利7769623、WO9514101等中记载了用复制缺陷型腺病毒将特定基因传递到癌症患者的病灶，在所述病灶表达由所述基因编码的特定抑制肿瘤的蛋白质以达到治疗癌症的目的。在体外的试验中，这种方法是成功的，但在体内，有效率大大降低。这种基因治疗的方法到目前为止，还不能有效地修复缺陷的原癌基因或肿瘤抑制基因。肿瘤自身的细胞生物学特性使得现今还没有一种有效的方法能治疗癌症，而且所有基因治疗的方法都太昂贵，这也限制了它的应用。腺病毒可以感染呼吸道、眼、胃肠道和膀胱，已经鉴定出47个血清型。根据其血凝作用特性、致瘤性、对培养细胞的转化和G+C百分比，将人腺病毒分成7个亚型。腺病毒的复制循环分为早期和晚期两个阶段，晚期是从病毒DNA复制开始的。感染后，腺病毒迅速关闭细胞中DNA和蛋白质的合成。其关闭机制尚不清楚，但细胞中的蛋白质合成迅速受到抑制，而细胞DNA合成则稍晚。在32-36小时的一个病毒循环中，每细胞产生104个病毒颗粒。腺病毒基因组中有11个基因，其中E1A区在早期基因合成中是非常重要的。研究表明，E1A蛋白质可结合肿瘤抑制基因RB105(成视网膜细胞瘤105kd)，而E1B蛋白可结合P53肿瘤抑制蛋白。E1B本身不能转化细胞，但与E1A一起可稳定地转化细胞。E3区含有调节与宿主对感染反应有关的基因。正常情况下，腺病毒主要在细胞内有效的复制，它的核酸序列的E1B区基因编码合成P55蛋白，此蛋白能同宿主细胞中的P53蛋白结合，并使其失活从而阻止了细胞凋亡的发生，使病毒得以复制，这样缺失了P53蛋白功能的细胞可任病毒大量复制。通过这种方式，野生型腺病毒可在具有功能性P53蛋白的正常细胞中大量复制。美国专利5677178中公开了用重组腺病毒治疗肿瘤的方法，方法所使用的是由腺病毒II型(Ad2)和腺病毒V型(Ad5)构建的重组嵌合病毒dl1520，由于这种重组病毒不是天然存在于哺乳动物中的腺病毒，因此，这种病毒在人体中的生存状态以及潜在的可能突变和所引起的危害尚难以确定。此外，该方法所用的病毒还保留了1/9的E3区，而E3区有抑制人体免疫系统的作用，该区的部分保留已证明可使该病毒产生抗性，因而有可能在人体中长期存在。这样由于病毒的返祖现象，或由于其它因素的影响，该重组腺病毒会回复成可在正常人体细胞中表达的野生型病毒，从而对人体产生不利影响。由于复制缺陷型腺病毒的增殖是以特定的宿主，即肿瘤细胞为靶，因此当特定的靶组织消失后，要求破坏特定靶组织的所述复制缺陷型腺病毒也应随之从受体内消失，以免使所述复制缺陷型腺病毒在体内产生不需要的突变并保留在体内，而对宿主产生不利影响。因此，这就要求用于破坏特定靶组织的复制缺陷型腺病毒有尽可能高的靶特异性，从而使其只能在特定的靶组织中生活。为此，本专利技术人经过研究和试验构建了一种新型的重组腺病毒，它来源于Ad5。由于Ad5型腺病毒是天然存在于哺乳动物中的，它同人类的相互关系已经研究的非常明确，而且将E3区基因全部去除。这样，当此病毒在体内发挥药效后，人体自身的免疫系统可将之清除，从而避免了存留于体内可能产生的危害。因此，此新型的重组腺病毒的安全性优于现有技术改进的重组复制缺陷型腺病毒。本专利技术的目的是提供一种改进的重组复制缺陷型腺病毒，以及含有该病毒的药物组合物，此外，本专利技术还提供选择性杀死肿瘤细胞的方法。本专利技术的另一目的是提供选择性杀死肿瘤细胞的方法，该方法包括，在感染的条件下，将杀死肿瘤细胞有效量的E1B区p53缺陷的重组缺陷腺病毒与含有肿瘤细胞的细胞种群接触，由此产生感染的细胞种群，所述病毒为E1B/E1a双突变的病毒，并可进一步包含有一个与病毒启动子相连的阴性选择基因。另一方面，本专利技术提供含有重组复制缺陷型腺病毒及可药用载体的药物组合物。此外，本专利技术还提供了重组缺陷腺病毒在制备用于治疗肿瘤的药物组合物中的用途。附图说明图1.S98基因工程腺病毒图谱。图2.在正常细胞中，S98基因工程腺病毒的复制。图3.S98-001的药效学试验。本专利技术的复制缺陷型腺病毒为经过改造的Ad5。Ad5的基因组含有35935个核苷酸。Ad5与人类的关系十分清楚，有明显的自愈性。在已将Ad5全序列用于人的临床实验中，从未发生过转化正常人细胞的特性。本专利技术构建的重组复制缺陷型腺病毒如图1中所示的S98-001和S98-002。在S98-001中，在E1B区的2025核苷酸处加入了TGA终止密码子，同时缺失了核苷酸2501-3328，同时缺失了包括核苷酸27865-30995的整个E3区。由于E1B编码P55蛋白，所以上述缺失使得复制缺陷型腺病毒只能生产出缺陷型P55蛋白质，而所述缺陷型P55蛋白同p53基因产物的结合能力大大降低或与之不能结合。因此，所述缺陷型Ad5不能在含有正常p53基因产物的正常细胞中复制，而只能选择性地在p53功能缺陷的肿瘤细胞中大量复制，最终通过所述腺病毒的大量复制而杀死肿瘤细胞。由于该腺病毒是p53缺陷型的，因此，当体内肿瘤细胞被基本上全部杀死后，这些腺病毒因不能在正常细胞中复制最终也会死亡。因此，这些复制缺陷型病毒对于正常细胞来讲是安全的。E3区是与宿主免疫系统有关的区域，该区的存在有可能使腺病毒抵御宿主免疫系统，因此在本专利技术中，完全缺失了E3区。此外，由于本专利技术的重组腺病毒完全缺失了E3区，从而进一步降低了该病毒进入人体后会给人体带来危害的可能性。本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组的复制缺陷型腺病毒，其特征在于该病毒不能表达可与细胞内功能性ｐ５３肿瘤抑制基因产物结合的蛋白并缺失了Ｅ３区。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张晖，
申请(专利权)人：杭州赛狮生物技术开发有限公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]