提供了转录因子Ｅ２Ｆ和成视网膜细胞瘤蛋白ＲＢ的融合体以及治疗高增殖性疾病的方法。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
技术介绍
成视网膜细胞瘤基因(RB)和转录因子E2F在细胞生长控制中都具有关键作用(可参见Adams，P.和Kaelin，W.Seminars in Cancer Biology699-108(1995)的综述)。在各种人类肿瘤细胞中，RB基因座常常被失活。将野生型RB基因(如Bookstein等人，Science 247712-715(1990))或野生型RB蛋白(pRB)(如Antelman等人，Oncogene 10697-704(1995))再引入RB阴性/RB突变细胞可以抑制这些细胞在培养过程中的生长以及这些细胞的体内肿瘤发生能力。E2F的作用是激活S期基因的转录，而RB抑制它的活性。RB通过阻断从G期进入S期的出口而使细胞生长停滞(例如，Dowdy等人，Cell73499-511(1993))，但其阻滞作用(arrest)的准确途径还是不清楚的。尽管E2F与RB形成复合体，但如果存在一种E2F相关蛋白DP-1的话，则复合体的形成会更有效率。E2F-1和DP-1形成稳定的异二聚体，结合DNA(例如，Qin等人，Genes and Dev.6-953-964(1992))。DP-1-E2F复合物的作用是协同激活依赖于E2F的基因的转录。象阻抑受E2F-1或DP-1激活的转录一样，pRB能以同样的方式阻抑这样的转录。在一些情况下，可以通过将pRB连接到一个启动子上而获得RB对基因的转录阻抑。例如，GAL4-pRB融合体结合于GAL4 DNA结合域并阻抑从p53、Sp-1或AP-1元件的转录(Adnane等人，J.Biol.Chem.2708837-8843(1995)；Weintraub等人，Nature 358259-261(1995))。Sellers等人(Proc.Natl.Acad Sci.9211544-11548(1995))公开了E2F的氨基酸残基1-368和RB的氨基酸379-792或379-928的融合体。Chang等人(Science 267518-521(1995))公开了用一种复制缺陷型腺病毒-RB构成物在两个再狭窄动物模型中减少新内膜的形成，其中所述再狭窄是一种高增殖性疾病。专利技术概述本专利技术提供了下述惊人的结果E2F多肽与RB多肽的融合体在阻抑E2F启动子的转录中比单独的RB更有效，并且这样的融合体能在各种细胞类型中使细胞周期停滞。因此这样的融合体可以满足治疗高增殖性疾病、包括癌症的迫切需要。本专利技术的一方面是包含一种转录因子与一种成视网膜细胞瘤(RB)多肽的融合体的多肽，其中所述转录因子包含一个DNA结合域，所述RB多肽包含一个生长抑制域。本专利技术的另一方面是编码这样一种融合多肽的DNA。可以将所述DNA插入一种腺病毒载体中。在本专利技术的一些实施方案中，所述转录因子是E2F。所述E2F的细胞周期蛋白A结合域可以缺失或是没有功能的。在一些实施方案中，所述E2F可以包含氨基酸残基约95到约194或约95到约286。所述成视网膜细胞瘤多肽可以是野生型RB、RB56、或上述多肽的一种变异体或一个片段。在一些实施方案中，所述成视网膜细胞瘤多肽包含氨基酸残基约379到约928。所述RB多肽上优选的氨基酸取代包括残基2、608、788、807和811。本专利技术的另一方面是包含编码一种多肽的DNA的表达载体，所述多肽包含一种转录因子与一种成视网膜细胞瘤(RB)多肽的融合体，其中所述转录因子包含一个DNA结合域，所述RB多肽包含一个生长抑制域。在一些实施方案中，一种组织特异性的启动子操纵性地连接到编码该融合多肽的DNA上。所述组织特异性启动子可以是一种平滑肌α-肌动蛋白启动子。本专利技术的另一方面是一种用于治疗高增殖性疾病的方法，包括给予患者治疗有效量的一种E2F-RB融合多肽。所述高增殖性疾病可以是癌症。在一些实施方案中，所述高增殖性疾病是再狭窄。所述融合多肽和编码该融合多肽的核酸可用于包被血管成形术所使用的装置。附图简述附图说明图1A描述了预测的E2F的氨基酸序列。图1B描述了转录因子E2F的核苷酸序列。图2A描述了如Lee等人(Nature 329642-645(1987))公开的pRB的核苷酸序列。图2B描述了预测的pRB的氨基酸序列。图3是pCTM的图示。图4描述了质粒pCTM的核苷酸序列。图5是pCTMI的图示。图6描述了pCTMI的核苷酸序列。图7是质粒pCTMIE的图示。图8描述了pCTMIE的核苷酸序列。图9是一个简图，描述了实施例中使用的E2F-RB融合构成物。所有的E2F构成物都起始于氨基酸95并且缺失部分细胞周期蛋白A结合域。E2F-437包含DNA结合域(黑)、异二聚化域(白)以及反式激活域(条纹)。E2F-194仅包含DNA结合域。E2F-286包含DNA结合域以及DP-1异二聚化域。为产生E2F-194-RB56-5s和E2F-286-RB56-5s，将E2F构成物符合读框地融合到RB的密码子379上。C706F是一个致失活点突变。图10是一个简图，描述了E2F-RB融合构成物引起的转录阻抑。图11(A-D)描述了在哺乳类细胞系中E2F-RB融合蛋白的表达。由E2-CAT报道分析或FACS分析中使用的细胞制备提取物，并使用一种抗RB的单克隆抗体进行分析。板A显示了用以下转染C33A细胞得到的结果(3)RB56-H209，(4)RB56野生型，(5)RB56-5s，(6)E2F286-5s，(7)E2F194-5s，(8)E2F194，(9)E2F286，(10)E2F437。泳道(1)是RB56蛋白标准品。泳道(2)是一个模拟转染。板B显示了用以下转染Saos-2细胞得到的结果(1)RB56，(2，3)E2F194-5s，以及(4，5)E2F286-5s。板C显示了用以下转染5637细胞得到的结果(2，3)RB56野生型，(4，5)RB56-5s；(6，7)E2F194-5s；(7，8)E2F286-5s。泳道(1)是RB56蛋白标准品。板D显示了用以下转染NIH-3T3得到的结果(3)RB56，(4)E2F286-5s，(5)E2F194-5s。泳道(1)是RB56标准品；泳道(2)是RB110标准品。图12描述了对表达RB的NIH-3T3细胞使用流式细胞术得到的频率分布图分析。图13的组A描述了在大鼠平滑肌细胞系A7R5中进行的一个3H-胸苷摄入分析中，CMV驱动的重组腺病毒(ACN56)以及人类平滑肌α-肌动蛋白驱动的E2F-p56融合构成物的两个分离物与一种对照病毒(ACN)的效应的比较，其中所述E2F-p56融合构成物包含直接或符合读框地连接到p56(RB cDNA的氨基酸379-928)上的E2F氨基酸95到286。组B描述了同样的构成物在大鼠平滑肌细胞系A10中的效应。图14描述了图13所述各种病毒在非肌细胞中的效应的比较。组(A)描述了在乳腺癌细胞系MDA MB468中的结果。组(B)描述了在非小细胞肺细胞癌细胞系H358中的结果。图15上面的一组描述了腺病毒对不同细胞系的相对感染性，其中相对感染性是在用等量的一种由CMV启动子驱动表达β-gal的重组腺病毒感染细胞后，根据β-半乳糖苷酶(β-gal)染色的水平来进行判定。H358是非小细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，包含一种转录因子和一种成视网膜细胞瘤（ＲＢ）多肽的融合体，其中所述转录因子包含一个ＤＮＡ结合域，所述ＲＢ多肽包含一个生长抑制域。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：D安特尔曼，RJ格雷戈里，KN维尔斯，
申请(专利权)人：坎吉有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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