拟南芥△1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的启动子制造技术

利用全长Ｐ５ＣＳ１ｃＤＮＡ作为探针经噬斑杂交对拟南芥Ｃｏｌｕｍｂｉａ生态型的基因组ＤＮＡ文库进行筛选。纯化阳性克隆。将这些克隆作亚克隆，并通过循环测序法确定其序列。然后将系列缺失的ＤＮＡ连接上ＧＵＳ基因并导入拟南芥。利用转基因拟南芥植物，分析确定ＧＵＳ基因活性，查出Ｐ５ＣＳ１启动子的活性区。清楚地表明在水分胁迫下，拟南芥的Ｐ５ＣＳ１启动子能调控基因的表达。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及拟南芥Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因的启动子(下文中称为P5CS)。它可以用于利用基因重组来构建新植物，或用于使培养细胞再生以便生产有用物质。众所周知，许多植物，包括盐生植物，在受到渗透压胁迫时能积累相适应的脯氨酸。这提示在植物器官中积累的脯氨酸能起到保持植物器官中的水分的作用。在植物中，脯氨酸是由谷氨酸经P5CS酶和Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶(下文中称为P5CR)的作用产生的。在植物中脯氨酸积累在器官中，在处于干旱或渗透压胁迫等水分逆境时，这种情况意味着植物很难获得水分，P5CS的活性以及P5CS基因的表达水平会增强，然而，P5CR的活性和P5CR基因的表达水平不变并维持在一个低水平。这提示P5CS的表达控制着水分胁迫下植物中脯氨酸产生的一个限速步骤(Yoshiba等，植物杂志7751-760(1995))。另外，P5CS基因的表达不仅受到水分逆境比如干旱或渗透压胁迫的诱导，还受到一个脱落酸(ABA)依赖性途径的诱导。P5CS基因的表达在没有渗透压胁迫的情况下被阻遏(Yoshiba等，植物细胞生理学381095-1102(1997))。常规的基于植物载体的启动子是一种来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)基因的启动子，或者是来源于根癌农杆菌(这是一种土壤微生物)之Ti质粒的基因的启动子。这些启动子被用做使导入植物的基因有效地进行表达的启动子。目前已建立了一种可用于将基因导入植物的技术。另外还构建了并应用了一种能使导入植物的基因有效地表达的启动子。上述基于植物载体的启动子是一个例子。附图说明图1A代表性地显示了将启动子101与导入植物的基因结合在一起，从而由该启动子诱导基因的表达。然而，在导入基因后，这些常规的启动子可使基因表达，而不区分植物的生长阶段或植物部位。对于植物生长来说，没有必要使基因普遍性地表达，而且普遍性的基因表达在很多情况下对植物生长无益而有害。因此，如果能根据所需控制基因表达的话，将对植物生长非常有用。这就是说，如果可能建成特异于某一生长时期的启动子、特异于一种植物组织的启动子或特异于一种环境条件的启动子，就能任意控制结合在该启动子下游的基因的表达，并仅在需要时使其表达。图1B-图1E代表性地显示了上述内容。图1B显示基因102结合了一种应答环境条件的启动子103的情形。图1C显示基因104结合了特异于一种植物组织的启动子105的情形。图1D显示基因106结合了针对某一生长时期的启动子107的情形。此外，图1E显示基因102、104和106顺序结合在一起并导入植物的情形，并且上述特异于每个条件的启动子顺序导入结合的基因的上游。根据上文，本专利技术目的在于利用P5CS基因的启动子来设计一种启动子，P5CS基因的启动子能根据环境条件来调控基因表达，当环境条件变坏时启动基因表达，而环境条件恢复成良好时关闭基因表达。根据本专利技术设想的P5CS基因的启动子，能实现对有用基因的表达的诱导或阻遏这样的调控，其中的有用基因是连接在启动子下游、对环境胁迫有抗性的基因族。因此，根据土壤环境的变化，有可能使要控制的有用植物对环境胁迫有抗性。另外如果P5CS基因的启动子连接上一个能将植物组织染色的基因，就有可能根据环境条件监测变劣情况。这意味着可能获得一种能对环境胁迫作出反应的监测植物。已知当受到水分胁迫时(这使植物变得难于获得水份)，比如干旱或盐度胁迫，许多植物在细胞中积累脯氨酸(一种氨基酸)。脯氨酸是由两种酶即P5CS “Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶”和P5CR“Δ1-吡咯啉-5-羧酸还原酶”合成的。已知在水分胁迫下，P5CS是脯氨酸合成的限速步骤。此外还知道在水分胁迫，比如干旱或渗透压胁迫下以及给予脱落酸(ABA)时，P5CS基因的表达被迅速诱导，在消除这些胁迫和脱落酸(ABA)时，表达被迅速阻遏。这样，专利技术人有了如下想法P5CS基因的启动子能根据环境条件诱导基因的表达。即在给予植物环境胁迫或消除这种胁迫的情况下，基因的表达受到P5CS启动子的控制。因此，对包含来自拟南芥的P5CS基因的启动子区域之基因组DNA进行了克隆和序列分析。取出P5CS基因的启动子区域，结合于β-葡糖醛酸糖苷酶基因，然后将嵌合基因导入植物。已经证实导入了嵌合基因的植物中葡糖醛酸糖苷酶基因的表达在脱水胁迫或渗透压胁迫下经脱落酸(ABA)的生物合成被诱导。P5CS基因的启动子在水分胁迫下能控制基因的表达得到了证实，这样就完成了本专利技术。这就是说，本专利技术提供了一种包含P5CS基因之启动子的DNA。另外本专利技术提供了一种包含上述DNA的用于植物的载体。图1A-图1E分别代表性地显示了用于植物的载体和基因表达之间的关系。图2显示了序列表中SEQ ID NO1所描述的基因组DNA的前一部分的核苷酸序列，该部分序列根据其功能进行了重新编号。图3显示了序列表中SEQ ID NO1所描述的基因组DNA的后一部分的核苷酸序列，该部分序列根据其功能进行了重新编号。图4显示对转基因拟南芥植物中P5CS启动子及其缺失系列对脱水的反应性进行了分析，其中从上游(5’位点)删除了本实施方案的DNA，并将它与下游带有外源基因的载体结合在一起。图5显示了质粒P5CS-Pro/GUS的基因图谱，该质粒是利用植物载体pBI101上包括的β-葡糖醛酸糖苷酶(GUS)基因和序列表中SEQ IDNO1所描述的P5CS启动子构建的(启动子结合在GUS的前面)。图6A和6B的照片显示带有本专利技术所述启动子的基因的表达结果。如上所述，本专利技术的DNA包含P5CS启动子。虽然对P5CS启动子的来源没有特殊限定，序列表中SEQ ID NO1所显示的本实施方案公开了克隆自拟南芥的P5CS基因及其启动子部分。序列表中SEQ ID NO1显示了克隆自拟南芥P5CS的启动子区域之基因组DNA的核苷酸序列，及其第一个外显子。为了便于解释，序列表中SEQ ID NO1所示的基因组DNA的核苷酸序列依照其功能进行了重新编号，如图2和图3所示。由于纸张的显示区狭窄，SEQ ID NO1所示基因组DNA的核苷酸序列的上游部分和下游部分分别示于图2和图3。在图3的核苷酸序列中，箭头指示的碱基对和符号+1表示转录起始位点，从+124 atg开始的碱基对表示编码P5CS蛋白第一个氨基酸的序列。在序列加有下划线的-30处识别出基因转录所需的TATA盒。应答ABA这种植物激素的ABRE顺式作用基元位于序列中加有下划线的-86处。另外，我们认识到存在一个预计转录因子(MYC和MYB)会与之结合的序列以及顺式作用基元CCAAT。在本实施方案中，将位于SEQ ID NO1所示基因组DNA的核苷酸序列中-1064到+70的DNA结合到载体上，以便使位于该DNA下游的外源基因表达。图4显示对转基因拟南芥植物中P5CS启动子及其缺失系列对脱水的反应性进行了分析，其中从上游(5’位点)删除了本实施方案的DNA并将它与下游带有外源基因的载体结合在一起。图4中，从上游(5’位点)所缺失的某些DNA示于左侧，下游中外源基因的表达示于右侧。左侧显示的数字意味着以图2和图3中的序列表所显示的碱基对+1为基础的碱基对编号。顺式作用基元(CCAAT)、转录因子(MYC和MYB)、应答ABA(ABRE)的顺式作用基元以及本文档来自技高网...

【技术保护点】
包含Δ↑［１］－吡咯啉－５－羧酸合成酶基因的启动子的ＤＮＡ片段。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：吉羽洋周，
申请(专利权)人：株式会社日立制作所，
类型：发明
国别省市：JP[日本]