G-CSF受体兴奋剂抗体及其筛选方法技术

本发明专利技术涉及一种兴奋剂分子，其可特异性地结合人体Ｇ－ＣＳＦ受体或与其相互作用，并将受体二聚化或活化与受体相关连的激酶磷酸化而刺激细胞增生和分化。此兴奋剂分子包括单克隆抗体，或片断，同源物或其类似物，或肽或有机化合物。公开了二种小鼠单克隆兴奋剂抗体的例子：ｍＡｂ１６３－９３及ｍＡｂ１７４－７４－１１。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
骨髓中血细胞生长，分裂及分化过程称为造血过程(Dexter,T.M.及Spooneer,E.,细胞生物学年鉴,3:423,1987)。有许多不同类型的血细胞属于可区别细胞谱系。各不同血细胞类型源自多能干细胞，其可进行自我更新，或生成祖先细胞而得分化成所有不同的成熟细胞型。活体内一般细胞有三种型式红血球细胞，血小板及白血球细胞，大多数白血球细胞参与宿主免疫防御反应。造血前体细胞的增生及分化由一个细胞因子家族调节，含集落刺激因子(CSFs)及白细胞介素(Arai,K-I.，等人，Annu.Rev.Biochem.1990,59:783-836)。至少四种细胞因子涉及产生嗜中性白血球及巨噬细胞，即白细胞介素-3(IL-3)，粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)及巨噬细胞刺激因子(M-CSF)。其中，G-CSF专一作用于限于嗜中性白血球粒细胞谱系的细胞(Demetri,G.D.,and Griffin,J.D.,Blood,1991,78:2791-2808)。G-CSF于活体内的主要生物作用为从指定的祖先细胞增加嗜中性白血球的增生及分化(Cohen,A.M.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:2484-2488)。G-CSF也可促进成熟嗜中性白血球的迁移，存活及功能，包括增加吞噬细胞活性及抗微生物的杀伤性(Crawford,J.,等人,N.Engl.J.Med.,1991,325:164-170,Moore,M.A.S.,Annu.Rev.Immunol.1991,9:159)。此生理过程可作为关键性宿主防御系统的基础且可于活体内大规模发生。市售重组人类G-CSF(Neupogen_,Amgen,Inc.)于活体内的半寿期仅为3.5小时，且应每日用药以维持临界值量的G-CSF以刺激嗜中性白血球的生成(Physician’s Desk Reference,53rd,1999,532-537)。高剂量重组人类粒细胞集落刺激因子(″rhG-CSF″)疗法的主要副作用为骨疼痛，很可能是因注射后活体内rhG-CSF瞬时量过高；然而，此较不常发生于接受低剂量rhG-CSF的病人。已研发各种方法以延长rhG-CSF的活体内半寿期，包括偶合以聚乙二醇(PEG)。然而，一个近来报导指出PEG偶合物较未修饰蛋白质活性为低，因偶合至蛋白质的PEG组域分子量与活体外活性有反关连。参见BowenS.,等人，Exp.Hemat.,1999,27:425-432。此外，动物研究的数据指出rhG-CSF偶合以PEG可延长半寿期至1～3天，但不超过此。与PEG偶合至rhG-CSF相反，单克隆抗体(″mAb″)的活体内半寿期约为2-3周，是视抗体同种型而定。预期单次注射入抗人体粒细胞集落刺激因子受体的兴奋剂抗体可提供粒细胞集落刺激因子样活性数周。因此，化疗及严重慢性嗜中性白血球减少症的病人将受益于此，因兴奋剂单克隆抗体的较长生物活性而降低到医院次数。此外，血液循环中兴奋剂抗体的持久水平可持续刺激嗜中性白血球祖先细胞的增生及分化，而表现较高潜力，造成低剂量用量且降低Neupogen_或其它rhG-CSF衍生物的副作用。各种G-CSF作用是由经其2个分离结合位结合G-CSF至其受体，形成1∶2配体/受体复合物而引发。此粒细胞集落刺激因子受体，在嗜中性粒性白血球的祖先细胞及在成熟的定形细胞上表达，是属于细胞因子/造血受体的超家族。虽然多数此家族成员，包括白细胞介素-2(IL-2)至白介素-7(IL-7)的白介素受体及GM-CSF，是由形成含α,β，及有时甚至γ亚基的杂聚复合物而活化，粒细胞集落刺激因子受体蛋白质，由单链多肽组成，已知可由配体结合形成同二聚复合物(Fukunaga,R.,等人,J.Bio.Chem.,1990,265:14008)。已知G-CSF受体的同二聚化为信号转导所必需(Wells,J.A.,and Vos,A.M.,Annu.Rev.Biochem.,1996,65:609)。G-CSF受体不含内部蛋白激酶功能域，虽然酪氨酸激酶活性为转导粒细胞集落刺激因子信号所必需。由G-CSF诱导的受体同型二聚化导致的G-CSF受体活化信号可由非共价结合各种酪氨酸激酶来介导，如JAKl及JAK2(Barge,R.M.Y.,等人，Blood,1996,87:2148-2153),随后磷酸化转录因子Stats如Stat3及Stat5(Tian,S-S.，等人，Blood,1994,84:1760-1764；Watowich,S.S.，等人，Annu.Rev细胞Dev.Biol.,1996,12:91；Dong F.，等人，J.Inmunol.,1998,161:6503-6509)。这些酪氨酸激酶为G-CSF受体磷酸化及与G-CSF反应的Stat活化所必需(Tian S-S.等人，blood,1996,88:4435-4444；Shimoda,K.，等人，Blood,1997,90:597-604)。除了G-CSF受体，但红细胞生成素(″EPO″)受体，生长激素(″GH″)，催乳素受体(″PRL″)及血小板生成素(″TPO″)也显示可由配体引发受体同二聚化，造成特定激酶磷酸化而触发(Youssoufian,H.，等人Blood,1993,81:2223；Alexander,W.S.，等人，EMBO,1995,14:5569；Heldin C.H.,Cell,1995,83:213)。因此，本专利技术公开的筛选方法，是用以筛选粒细胞集落刺激因子受体兴奋剂，它基于其引起经同型二聚体化的信号转导及携带受体的细胞的增生，该方法也可用以筛选针对其它受体的兴奋剂。专利技术概要本专利技术是关于对粒细胞集落刺激因子受体及其它同二聚化细胞因子受体有反应力的兴奋剂分子，其是借结合至此受体或与其相互作用，起着与配体相同的生物学作用。本专利技术包括兴奋剂分子，其可结合2个细胞因子受体蛋白质或与其相互作用，更优选的是，与2个相同细胞因子受体蛋白质，如2个G-CSF受体蛋白质结合或相互作用。此兴奋剂分子含整个抗体分子，包括多克隆及单克隆抗体，及修饰或其衍生物，含免疫球蛋白片断如Fab,scFv及双价F(ab’)2，及可引起与天然G-CSF相同或类似兴奋剂效应的同源物或其类似物。此兴奋剂抗体及片断可源自动物，人小鼠嵌合体，人源化，去免疫化抗体或全部源自人。在优选的实施方案中，G-CSF受体兴奋剂可刺激表达G-CSF受体的细胞生长及/或分化。其是由结合自G-CSF受体细胞外结构域，将G-CSF受体二聚化及/或将与G-CSF受体相关激酶活化磷酸化。此表达G-CSF受体的细胞一般含原始干细胞/造血祖先细胞，因此兴奋剂可促进原始造血细胞分化及/或增生导至嗜中性粒性白血球谱系的细胞再生。本专利技术另一领域是关于筛选同二聚化细胞激素受体兴奋剂的方法，如G-CSF受体兴奋剂抗体，使用活体外细胞分析系统。如下述，将细胞转染以G-CSF受体，或G-CSF受体部份当结合兴奋剂后可被活化，细胞可于存在兴奋剂分子下监测其增生。本专利技术也关于使用此兴奋剂，含兴奋剂抗体，用于诊断及治疗。此杂交瘤产生兴奋剂抗体命名为单克隆抗体mAb本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种兴奋剂分子，其可特异性结合人类Ｇ－ＣＳＦ受体或与其相互作用以刺激细胞增生及分化。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：倪宝福，比尔NC孙，舍西利RY孙，
申请(专利权)人：泰诺士公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]